外源质粒DNA经胃肠道途径对小鼠免疫功能的影响

摘要

目的: 研究外源质粒DNA经胃肠道吸收后对小鼠免疫功能的影响.

方法: 观察外源质粒pcDNA3对小鼠胸腺、脾脏指数, 脾脏淋巴细胞转化率, 脾脏抗体细胞生成含量, 血清溶血素水平, 巨噬细胞吞噬指数及吞噬率的影响, 并考察了外源质粒pcDNA3对免疫低下小鼠血清IgA、IgG及IgM的影响.

结果: 外源质粒pcDNA3经胃肠道摄入后能够提高胸腺指数(3.53±0.80 vs 5.10±0.47 mg/g, P<0.05)、脾脏指数(5.69±0.92 vs 7.49±1.18mg/g, P<0.05)、脾脏淋巴细胞转化率(1.047±0.012 vs 1.154±0.016, P<0.05)、脾脏抗体细胞生成含量(0.403±0.008 vs 0.471±0.007, P<0.05)、血清溶血素水平(6.46±0.12 vs 8.18±0.29, P<0.05)、巨噬细胞吞噬指数(0.53±0.017 vs 0.72±0.029, P<0.01)及吞噬率(32.30±1.098 vs 60.53±2.022, P<0.01), 并且能够恢复免疫低下小鼠血清IgA、IgG及IgM的水平.

结论: 外源质粒DNA经胃肠道途径摄入后能够诱导小鼠广泛的体液免疫和细胞免疫应答.

关键词: N/A

Effect of oral administration of foreign plasmid DNA on immune function in mice

Jian-Wen Liu, Yong-Hui Shi, Guo-Wei Le

Jian-Wen Liu, Yong-Hui Shi, Guo-Wei Le, Institute of Food Nutrition and Safety, Department of Biotechnology, Southern Yangtze University, Wuxi 214036, Jiangsu Province, China

Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30270970.

Correspondence to: Dr. Guo-Wei Le, Department of Nutrition and Biotechnology, Southern Yangtze University, 170 Huihe Road, Wuxi 214036, Jiangsu Province, China. lgw@sytu.edu.cn

Received: July 20, 2004
Revised: September 13, 2004
Accepted: September 19, 2004
Published online: November 15, 2004

Abstract

AIM: To investigate the effect of foreign plasmid DNA on immune function in mice through oral administration.

METHODS: After oral administration of foreign plasmid pcDNA3, thymus and spleen index, anti- sheep red blood cell (SRBC), number of antibody secreting cell (NASC) in spleen and phagocytic activity were detected. lymphocytic transformation rate (LTR) in spleen was determined using MTT methods. Serum IgA, IgG and IgM in immune suppression mice were also examined with immunoglobulin kit.

RESULTS: Thymus and spleen index, LTR, anti-SRBC and NASC in spleen significantly increased after administration of foreign plasmid pcDNA3 (3.53 ± 0.80 vs 5.10 ± 0.47 mg/g, P < 0.05; 5.69 ± 0.92 vs 7.49 ± 1.18 mg/g, P < 0.05; 1.047 ± 0.012 vs 1.154 ± 0.016, P < 0.05; 6.46 ± 0.12 vs 8.18 ± 0.29, P < 0.05; 0.403 ± 0.008 vs 0.471 ± 0.007, P < 0.05; respectively). Phagocytic activity also increased significantly (phagocytic index: 0.53 ± 0.017 vs 0.72 ± 0.029, P < 0.01); (phagocytic ratio: 32.30 ± 1.098 vs 60.53 ± 2.022, P < 0.01). The serum IgA, IgG and IgM of immune suppression mice resumed to normal level.

CONCLUSION: Foreign plasmid DNA can induce humoral and cell mediated immune in mice after administration via the gastrointestinal tract.

Key Words: N/A

0 引言

长期以来人们一直把DNA作为一种遗传物质, 将其与免疫活性联系起来只是近20年来的事情. 细菌DNA不仅可以诱发抗体, 还能调节小鼠B细胞和T细胞的功能, 并刺激巨噬细胞产生细胞因子, 增强机体天然免疫[1]. 外源质粒pcDNA3作为DNA疫苗的典型载体, 其质粒骨架上含有非甲基化的CpG序列, 非甲基化的CpG序列具有免疫刺激作用, 能够促进多种免疫细胞活化, 诱导细胞因子的产生, 使机体产生快速高水平的抗体应答及细胞免疫应答[2-14]. 外源质粒DNA进入肠道后直接激活肠道抗原递呈细胞特异性递呈抗原到T和B淋巴细胞上, 诱导抗原特异性免疫应答. 一部分外源质粒DNA可以穿透肠黏膜被组织中的免疫细胞所识别并激活免疫应答. 我们口服给药, 研究外源质粒DNA通过肠黏膜吸收对机体产生免疫应答的影响.

1 材料和方法

1.1 材料

昆明种小鼠, ♂, 体质量20±2 g, 由江苏省实验动物中心提供. 质粒pcDNA3与含有pcDNA3的大肠杆菌DH5α由本室保存. 大量摇瓶发酵5 L含有pcDNA3的E.coli DH5α, 碱裂解法提取, 聚乙二醇纯化, Triton X-114去除内毒素, 检测质粒样品260/280>1.8, 同时进行8 g/L琼脂糖凝胶电泳确保DNA的完整性并无RNA[15]. RPMI1640培养基、小牛血清、MTT、谷氨酰胺和ConA均购自上海华美生物工程公司, 绵羊红细胞(SRBC)购自无锡市汇生试剂有限公司, 豚鼠血清自制. 其他试剂均为国产分析纯.

1.2 方法

健康昆明种小鼠40只, ♂, 随机分成4组, 1组 pcDNA3溶液1 g/L, 200 μL; 2 组 pcDNA3溶液0.1 g/L, 200 μL; 3组calf thymus DNA 1 g/L, 200 μL; 4组 生理盐水溶液200 μL. DNA样品临用前用生理盐水溶液溶解.

1.2.1 实验1: 前3 d连续给小鼠灌胃3 d, 实验10 d眼球采血处死. 称取体质量, 无菌取脾脏、胸腺, 称质量, 分别计算脏器指数=脏器质量(g)/体质量(g). (1)脾脏淋巴细胞转化率(SI)测定采用MTT比色法[16]. 无菌分离小鼠脾脏, 放在盛有PBS液的培养皿中, 按常规方法分离脾脏淋巴细胞, 最后将细胞重悬于RPMI1640完全培养基中, 并将细胞浓度调成2×10⁹ /L. 在96孔板中加入细胞悬液200 μL, 每个样品设3个阳性孔, 3个阴性对照孔, 阳性孔中加入10 mg/L的ConA, 对照孔不加ConA. 在37 ℃, 5 mg/L CO2的培养箱中培养72 h, 结束培养前4 h, 每孔吸弃上清100 μL, 加入5 g/L的MTT10 μL, 继续培养至结束. 测定前每孔加入DMSO150 μL溶解甲肷沉淀, 于酶联免疫检测仪上570 nm处测定吸光度. 淋巴细胞转化率(SI)=A阳性/A阴性; (2)小鼠PMФ吞噬实验小鼠ip无菌PBS2 mL, 轻揉腹部3-5 min后, 用注射器抽取腹腔液少许, 滴加于干净载玻片上, 每片2-3滴. 将玻片放于平皿中, 盖好皿盖, 置37 ℃孵育1 h, 使巨噬细胞贴壁. 取出玻片, 用生理盐水轻轻洗去非贴壁细胞. 每张玻片加酵母悬液2滴, 将玻片置平皿内, 于37 ℃培养30-40 min. 取出玻片, 用生理盐水轻轻洗去未被吞噬的酵母菌. 用10 g/L戊二醛固定2-3 min, 再用生理盐水冲洗、风干, 用美蓝染色液染色1-2 min, 冲洗, 待干. 油镜观察巨噬细胞吞噬酵母菌的现象. 统计100个巨噬细胞中有多少个吞噬了酵母菌, 将吞噬酵母菌的巨噬细胞数除以100, 即为吞噬率. 再统计100个巨噬细胞中一共吞噬了多少个酵母菌, 将被吞噬的酵母菌总数除以100, 得出每个巨噬细胞吞噬酵母菌的平均数, 即为吞噬指数[17].

1.2.2 实验2: 前3 d连续给小鼠灌胃3 d, 实验6 d所有小鼠均ip 100 mL/L绵羊红细胞0.2 mL(约4亿个), 10 d摘眼球取血, 37 ℃水浴使血液凝固, 2 000 r/min离心10 min分离血清, 无菌分离脾脏. (1)抗体生成细胞含量(number of antibody secreting cell, NASC)SRBC定量溶血分光光度测定法. 取脾细胞密度为5×10⁹ /L的悬液, 2 g/L SRBC和100 mL/L豚鼠血清补体各0.5 mL, 混匀后于37 ℃的水浴锅中保温1 h. 然后3 000 r/min离心5 min, 吸取上清. 另设不加补体的细胞悬液作为空白, 处理方法同上. 于413 nm处以空白调零, 测定上清的吸光值. 以吸光度表示抗体生成细胞含量; (2)血清中抗SRBC特异性抗体(溶血素)测定, 参照文献[18]. 取经生理盐水稀释的小鼠血清样品50 μL(稀释20倍), 加入0.5 mL, 50 mL/L绵羊红细胞置于冰水浴中冷却, 并于每管中加入补体1 mL(以PBS按1:10稀释的豚鼠血清, 自制), 37 ℃水浴保温30 min. 冰水浴中止反应. 1 500 r/min离心5 min, 取上清1 mL, 加入都氏试剂3 mL, 置于试管内充分摇匀, 放置10 min后, 由于溶血产生的全部血红蛋白变成氰化血红蛋白, 呈稳定的红色, 于540 nm测定吸光度. 以生理盐水1 mL代替血清样品作为样品空白. 取0.25 mL试验用的, 经过洗涤和稀释的SRBC, 用都氏试剂稀释至4 mL, 摇匀, 放置10 min, 540 nm 比色, 该值即为试验中所用SRBC半数溶血时的吸光度值. 样品HC₅₀＝(样品A值/SRBC半数溶血时A值)×稀释倍数.

1.2.3 实验3: 健康昆明种小鼠40只, ♂, 随机分成4组, 1组实验前1 d预先注射环磷酰胺(150 mg/kg)1次, 实验前3 d分别每天给小鼠灌胃pcDNA3溶液(1 g/L)200 μL/次; 2组实验前1 d预先注射环磷酰胺(150 mg/kg)1次, 实验前3 d分别每天给小鼠灌胃pcDNA3溶液(0.1 g/L)200 μL/次;3组实验前1 d预先注射环磷酰胺(150 mg/kg)1次, 实验前3 d分别每天给小鼠灌胃生理盐水溶液200 μL/次, 4组实验前1 d预先注射生理盐水溶液1次, 实验前3 d分别每天给小鼠灌胃生理盐水溶液200 μL/次; 实验10 d眼球采血分离血清. 小鼠血清IgA、IgG、IgM等3种免疫球蛋白水平的测定, 11 pcDNA3(1g/L, 200 μL)+环磷酰胺(150 mg /kg); 2 pcDNA3(0.1 g/L, 200μL )+环磷酰胺(150 mg/kg); 3环磷酰胺(150 mg/kg); 4 Saline Solution. 免疫球蛋白IgA、IgG、IgM水平测定采用温州医学院免疫球蛋白试剂盒.

统计学处理 结果采用SPSS 软件进行方差分析.

2 结果

2.1 小鼠脏器指数及脾淋巴细胞转化率

添加质粒pcDNA3能够提高小鼠的胸腺指数和脾脏指数, 其中灌胃0.1 g/L pcDNA3组的小鼠胸腺指数和脾脏指数均显著增加(P<0.05, 表1), 小牛胸腺DNA组小鼠的胸腺指数也略有增加, 但差异不显著. 灌胃质粒pcDNA3溶液的脾淋巴细胞转化率均高于对照组与小牛胸腺DNA组(P<0.05). 临床上通常用淋巴细胞的转化率来评价机体的免疫状况. 结果表明灌胃外源质粒pcDNA3溶液可显著(P<0.05)提高小鼠脾淋巴细胞的转化率, 促进淋巴细胞的转化, 是脾淋巴细胞的丝裂原.

表1 外源质粒pcDNA3对小鼠脏器指数、脾淋巴细胞转化率及腹腔巨噬细胞的影响.

分组	Thymus(mg/g)	Spleen(mg/g)	脾淋巴细胞转化率(SI)	吞噬率	吞噬指数
pcDNA3 1 g/L	3.81±0.19	5.77±0.78	1.261±0.004a	64.28±3.207bd	0.84±0.032bd
pcDNA3 0.1 g/L	5.10±0.47a	7.49±1.18a	1.154±0.016a	60.53±2.022bd	0.72±0.029bd
Calf thymus DNA 1 g/L	4.18±0.29a	5.46±0.59	1.067±0.009	34.68±1.031	0.58±0.016
4.Normal Saline	3.53±0.80	5.69±0.92	1.047±0.012	32.30±1.098	0.53±0.017

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs Normal Saline;

^dP<0.01 vs Calf thymus DNA.

2.2 腹腔巨噬细胞吞噬功能

灌胃质粒pcDNA3溶液的两组小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬率及吞噬指数均显著高于对照组(P<0.01, 表1), 显微镜下观察1组和2组PM体积明显增大, 表面突起而伸展. 这表明通过胃肠道途径灌胃质粒pcDNA3溶液, 可激活PM, 促进PM 的吞噬功能, 从而提高机体的免疫功能. 而第3组小牛胸腺DNA与对照组相比则差异不显著, 提示小牛胸腺DNA为真核DNA, 真核DNA上的CpG基序主要以甲基化形式存在, 无免疫刺激活性.

2.3 抗体生成细胞含量、溶血素及免疫球蛋白

灌胃pcDNA3质粒组的抗体生成细胞数量及溶血素水平均有升高的趋势, 其中灌胃0.1 g/L pcDNA3质粒组的血清溶血素水平明显高于对照组(P<0.05, 表2), 而小牛胸腺DNA组与对照组相比, 抗体生成细胞数量和溶血素水平均无增加的趋势(表2). 注射环磷酰胺小鼠血清免疫球蛋白水平明显低正常对照组(P<0.05, 表3), 灌胃质粒pcDNA3溶液后, 小鼠血清IgA、IgG 及IgM水平均高于免疫低下组(P<0.05, 表3), 且1 g/L pcDNA3组的三种免疫球蛋白水平均恢复到正常水平, 说明外源质粒DNA具有拮抗环磷酰胺致免疫低下的作用.

表2 外源质粒pDNA3对抗体生成细胞数量与溶血素水平的影响.

分组	NASC	Anti-SRBC
pcDNA3 1 g/L	0.431±0.002	6.59±0.11
pcDNA30.1 g/L	0.471±0.007a	8.18±0.29a
Calf thymus DNA 1 g/L	0.407±0.004	5.52±0.12
Normal Saline	0.403±0.008	6.46±0.12

^aP<0.05 vs Normal Saline.

表3 外源质粒pDNA3对环磷酰胺致免疫低下小鼠血清IgA、IgG及IgM水平的影响.

分组	IgA(g/L)	IgG(g/L)	IgM(g/L)
1 g/L, pcDNA3+环磷酰胺	1.29±0.12a	13.01±3.42a	1.17±0.29a
0.1 g/L, pcDNA3+环磷酰胺	0.77±0.11	10.12±2.16a	1.04±0.25a
环磷酰胺	0.69±0.16c	7.74±1.13c	0.88±0.08c
Normal Saline	1.16±0.45	12.11±3.61	1.07±0.62

^aP<0.05 vs 环磷酰胺;

^cP<0.05 vs Normal Saline.

2.4 免疫球蛋白(表2, 3)

3 讨论

细菌DNA本身就是一种免疫佐剂, 可有效地激活多种免疫效应细胞, 并刺激其分泌活性因子. 介导这一作用的是一类短核苷酸序列, 称为ISS. 这些序列绝大部分是由非甲基化的胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(CpG)为基序(motif)的寡聚体构成, 故又称CpG DNA . CpGDNA可促进在体内建立Thl型占优势的免疫应答, 诱导IL-12, IFN-γ等细胞因子的产生[19-22]. 5'-AACGTT-3'是一种具有较强活性的ISS, 在氨苄青霉素抗性基因(ampR)中含有他的两个拷贝. Johansson et al[23]发现注射质粒pcDNA3能够诱导细胞因子IFN-α的释放, pcDNA3作为一种DNA疫苗载体, 本身具有免疫刺激活性, 其免疫刺激活性与pcDNA3载体上的非甲基化的CpG基序有关. 与正常组小鼠相比, 给小鼠灌注pcDNA3, 小鼠胸腺指数、脾脏指数、脾脏淋巴细胞转化率、腹腔巨噬细胞吞噬功能、脾脏抗体形成细胞数量、血清中抗SRBC特异性抗体水平均有所升高; 而灌注小牛胸腺DNA组小鼠体增重、脾脏指数、血清中抗SRBC是特异性抗体水平等与对照组相比差异不显著. 值得关注的是灌注低剂量pcDNA3组小鼠胸腺指数、脾脏指数、抗体生成细胞数及血清溶血素水平均较其他组高, 差异显著(P<0.05). 灌胃0.1 g/L质粒pcDNA3对小鼠产生的免疫应答显著高于灌胃1 g/L质粒实验组. 高剂量灌胃给药可能引起小鼠产生免疫耐受, 从而是使免疫应答水平反而比低剂量低. 提示外源质粒DNA的免疫刺激作用具有一定的剂量依赖性. 实验还发现质粒DNA对环磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫功能具有恢复作用.

我们发现小牛胸腺DNA(甲基化DNA)经胃肠道途径吸收对小鼠基本上无免疫刺激作用. 提示对小鼠免疫系统产生刺激作用的是非甲基化DNA(如细菌DNA、细菌质粒等), 而甲基化DNA(如脊椎动物DNA)则无此作用. Johansson et al[23]也发现将pcDNA3上的CpG基序甲基化后, 则失去免疫刺激活性. 一般认为细菌DNA具有免疫刺激活性是因为细菌基因组中含有大量的非甲基化的CpG motif, 而脊椎动物基因组中CpG motif 的含量较少, 仅为细菌的1/4, 且80%以上为甲基化修饰, 因此不具有免疫刺激活性. 研究发现CpG motif中dC的第5位碳原子是否发生甲基化对其活性的影响非常重要, 将人工合成的CpG-ODN进行甲基化处理后, 免疫活性消失, 说明非甲基化的CpG motif是引起机体免疫应答的关键因素. 但对于哺乳动物来源的DNA, 即使将其去甲基化处理依然不能引起机体免疫应答.

以往的研究中表明外源质粒DNA经胃肠道摄入后, 能够在肠道中不完全降解, 以碎片的形式广泛分布于全身各个组织中[24-25]. 外源DNA经胃肠道吸收代谢及其对机体产生的影响并未引起人们的高度关注, 主要原因在于人们往往认为外源DNA(包括食品中的DNA)大部分在肠道中被降解, 作为核酸疫苗用DNA则主要采取肌肉注射或基因枪方式, 口服递呈抗原往往效价太低, 一直不被人们所重视. Shimosato et al[26]发现肠道中存在TLR-9(Toll-like receptor-9)受体. CpG-ODN刺激免疫细胞的作用机制主要是通过TLR9受体发挥作用的. TLR9主要表达于DC细胞 、B细胞、NK细胞、T细胞等, 可以识别CpG-ODN并与之结合, 激发细胞氧化还原平衡的改变, 通过MyD-88, IRAK, TRAF-8诱发细胞信号通路包括MAPK和NF-κB, 引起细胞活化, 启动固有性免疫应答[27-34].

备注

编辑:N/A

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