基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-11-15; 12(11): 2605-2609
在线出版日期: 2004-11-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i11.2605
HSP70在慢性情绪应激中对胃黏膜保护作用
朱熊兆, 彭敏, 姚树桥
朱熊兆, 彭敏, 姚树桥, 中南大学湘雅二院医学心理中心 湖南省长沙市 410011
朱熊兆, 女, 1965-03-13生, 湖南省双峰县人, 汉族, 1987年湖南医科大学本科毕业, 2000年中南大学湘雅医学院博士毕业, 副教授, 主要从事心身疾病方面的研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30170326; 湖南省自然科学基金资助项目, No. 01JJY2085
通讯作者: 朱熊兆, 410011, 湖南省长沙市人民路156号, 中南大学湘雅二医院医学心理中心. xiongzhao1@hotmail.com
电话: 0731-5361982
收稿日期: 2004-09-07
修回日期: 2004-09-13
接受日期: 2004-09-19
在线出版日期: 2004-11-15

目的: 探讨HSP70对心理应激导致的胃黏膜细胞凋亡是否具有保护作用及其可能的作用机制.

方法: 野生型小鼠70只, 随机分为对照组(n = 16), 热应激组(n = 18), 心理应激组(n = 18), 热应激加心理应激组(n = 18), 分别不给予任何实验应激, 给予热应激, 心理应激, 以及热应激加心理应激. 用免疫组化和TUNEL法分别在1, 2, 3 mo时段对胃黏膜细胞凋亡率和HSP70表达情况进行检测, 比较同一时段不同组之间的差异, 并探讨HSP70表达与胃黏膜细胞凋亡的关系.

结果: 1 mo时段, 胃黏膜细胞凋亡发生率在各组没有显著性差异(对照组, 热应激组, 心理应激组, 热应激加心理应激组分别为0.5±0.4%, 0.5±0.8%, 1.3±1.2%, 0.9±1.3%, F = 0.706, P = 0.561>0.05). 在2 mo时段心理应激组胃黏膜细胞凋亡发生率显著高于对照组(3.7±1.9% vs 1.3±1.4%, P = 0.017<0.05 ), 热应激组(3.7±1.9% vs 1.2±1.6%, P = 0.010<0.05), 热应激加心理应激组(3.7±1.9% vs 1.3±1.1%, P = 0.012<0.05). 3 mo时段心理应激组胃黏膜细胞凋亡发生率显著高于对照组(4.1±3.9% vs 1.0±1.1%, P = 0.025<0.05), 热应激组(4.1±3.9% vs 0.4±0.7%, P = 0.009<0.05), 热应激加心理应激组(4.1±3.9% vs 1.4±1.5%, P = 0.046<0.05). 在1 mo时段, 热应激组, 热应激加心理应激组HSP70表达率均分别显著高于对照组(64±11% vs 20±11%, P = 0.00<0.05, 72±6% vs 20±11%, P = 0.00<0.05) 和心理应激组(64±11% vs 34±15%, P = 0.00<0.05, 72±6% vs 34±15%, P = 0.00<0.05). 在2mo时段, 热应激组, 热应激加心理应激组HSP70表达率均分别显著高于对照组(84±13% vs 25±15%, P = 0.00<0.05, 87±7% vs 25±15%, P = 0.00<0.05)和心理应激组(84±13% vs 46±30%, P = 0.02<0.05, 87±7% vs 46±30%, P = 0.01<0.05). 在3 mo时段, 热应激组, 热应激加心理应激组HSP70表达率均分别显著高于对照组(61±16% vs 16±9%, P = 0.02<0.05, 65±29% vs 16±9%, P = 0.01<0.05)和心理应激组(61±16% vs 33±29%, P = 0.09 <0.05, 65±29% vs 33±29%, P = 0.046<0.05). HSP70表达率与胃黏膜细胞凋亡率呈负相关(r= -0.320, P = 0.008).

结论: 慢性心理应激使胃黏膜细胞凋亡发生率增加, HSP70可以降低胃黏膜细胞凋亡发生率, 在应激性溃疡的预防和治疗有重要的应用价值.

关键词: N/A
引文著录: 朱熊兆, 彭敏, 姚树桥. HSP70在慢性情绪应激中对胃黏膜保护作用. 世界华人消化杂志 2004; 12(11): 2605-2609
Protective effect of HSP70 on gastric mucosal cells against apoptosis
Xiong-Zhao Zhu, Min Peng, Shu-Qiao Yao
Xiong-Zhao Zhu, Min Peng, Shu-Qiao Yao, Clinical Psychology Research Center, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, Hunan Province, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30170326, and Natural Science Foundation of Hunan Province, No.01JJY2085
Correspondence to: Xiong-Zhao Zhu, The Clinical Psychology Research Center, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, Hunan Province, China. shuqiaoyao@hotmail.com
Received: September 7, 2004
Revised: September 13, 2004
Accepted: September 19, 2004
Published online: November 15, 2004

AIM: To investigate whether HSP70 can protect gastric mucosal cells from apoptosis induced by chronic emotional stress.

METHODS: Seventy mice were randomly devided into control group (n = 16), heat shock stress group (HS, n = 18), psychological stress group (PS, n = 18), heat shock stress plus psychological stress group (HPS, n = 18). Mice in HS, PS and HPS groups were subjected to heat shock stress, psychological stress, and heat shock stress plus psychological stress respectively. Apoptosis of gastric mucosal cells and the expression level of HSP70 were detected by TUNEL technique and immunohistochemical staining respectively after 1, 2, and 3 mo.

RESULTS: After 1 mo, apoptotic cells among the 4 groups were not significant. After 2 mo, apoptotic rate in PS group was significantly higher than control group (3.7 ± 1.9% vs 1.3 ± 1.4%, P = 0.017 < 0.05), SH group (3.7 ± 1.9% vs 1.2 ± 1.6%, P = 0.010 < 0.05), and HPS group (3.7 ± 1.9% vs 1.3 ± 1.1%, P = 0.012 < 0.05). After 3 mo, apoptotic rate in PS group was significantly higher than that in control group (4.1 ± 3.9% vs 1.0 ± 1.1%, P = 0.025 < 0.05), HS group (4.1 ± 3.9% vs 0.4 ± 0.7%, P = 0.009 < 0.05), and HPS group (4.1 ± 3.9% vs 1.4 ± 1.5%, P = 0.046 < 0.05). After 1 mo, HSP70 level was significantly higher in HS group and HPS group than that in control group (64 ± 11% vs 20 ± 11%, P = 0.00 < 0.05; 72 ± 6% vs 20 ± 11%, P = 0.00 < 0.05) and psychological stress group (64 ± 11% vs 34 ± 15%, P = 0.00 < 0.05; 72 ± 6% vs 34 ± 15%, P = 0.00 < 0.05). After 2 mo, HSP70 level was significantly higher in HS and HPS group than that in control group (84 ± 13% vs 25 ± 15%, P = 0.00 < 0.05; 87 ± 7% vs 25 ± 15%, P = 0.00 < 0.05) and PS group (84 ± 13% vs 46 ± 30%, P = 0.02 < 0.05; 87 ± 7% vs 46 ± 30%, P = 0.01 < 0.05). After 3 mo, HSP70 level was also significantly higher in HS and HPS group than those in control group (61 ± 16% vs 16 ± 9%, P = 0.02 < 0.05; 65 ± 29% vs 16 ± 9%, P = 0.01 < 0.05) and PS group (61 ± 16% vs 33 ± 29%, P = 0.09 < 0.05; 65 ± 29% vs 33 ± 29 %, P = 0.046 < 0.05). HSP70 level was negatively correlated with apoptotic rate of gastric mucosal cells (r = -0.320, P = 0.008 < 0.05).

CONCLUSION: Chronic emotional stress can induce apoptosis of gastric mucosal cells while HSP70 can protect them from apoptosis.

Key Words: N/A
0 引言

心理生理应激可损伤哺乳动物应激易感器官, 其中脑和胃是主要的易感器官[1], 可引起应激性溃疡. 关于心理应激在胃溃疡的诱发和加重中所起的作用是十分复杂的, 如果能够找到一种对胃黏膜细胞起到直接保护作用, 并提高细胞抗应激能力的方法, 将会降低应激性溃疡发病的可能性[2].

热休克蛋白尤其是HSP70可能在应对有害剌激使细胞易于存活的过程中起着重要的作用[1,3-7]. 心理应激能否引起胃黏膜细胞HSP70表达, 在应激性溃疡发生或加重过程中的作用机制尚不清楚, 因此, 对热应激和心理应激过程中胃黏膜细胞HSP70的表达、凋亡及其关系进行观察如下.

1 材料和方法
1.1 材料

采用美国德克萨斯大学西南医学实验中心培育的HSF1基因敲除杂合子进行交配, 经PCR基因型鉴定所得的野生型小鼠[8]. 所有小鼠在中南大学湘雅二医院实验动物中心饲养, 近交繁殖, 群养, 3-5只/盒. 选取2月龄小鼠入组. 饲养条件为: 光照12 h/d(8: 00/20:00), 室温24±0.5 ℃, 相对湿度60%, 照度220 lux, 屏蔽环境, 饲料、垫料以及饮水都经过严格的消毒. 入组动物70只, 随机分为A, B, C, D组. A组为对照组16只, B组为热应激组18只, C组为心理应激组18只, D组为心理应激加热应激组18只. 入组动物在1, 2, 3 mo三个时间段进行行为观察, 24 h后断头处死, 取所需标本.

1.2 方法

A组动物置于一安静环境中, 不接受任何实验性应激. B组动物为热应激组, 每周接受一次热应激. C组为心理应激组, 接受限制应激和饮水冲突应激. D组为心理应激加热应激组, 在接受限制应激和饮水冲突应激的基础上, 每周接受1次热应激. 心理应激包括饮水冲突应激和限制应激. 饮水冲突应激根据Vogel冲突模型和Geller-Seifter冲突模型设计而成[9]. 限制应激是将小鼠限制在一狭小的容器内(直径4 cm, 长为8 cm), 限制其活动范围, 使动物产生无助和抑郁的情绪, 每次限制30 min-1.5 h, 容器开口以保证充足的氧气供应. 热应激方法是根据既往研究经验, 反复进行预试验而设计的, 具体的方法是将一支体温计插入小鼠直肠内约3 cm处, 然后将动物放于一个自制的加热舱内进行加热. 舱内相对湿度约为60%. 待其直肠温度达到42 ℃时停止加热, 动物的直肠温度能保持在42 ℃达15 min[10-13]. 小鼠处死后, 取胃组织, 洗净胃内容物, 取胃溃疡好发部位: 胃大弯至胃小弯连线处胃黏膜, 立即用40 g/L多聚甲醛固定, 蒸馏水漂洗, 梯度脱水, 石蜡包埋, 切片.

1.2.1 TUNEL法检测胃黏膜细胞调亡: 石蜡切片常规脱蜡入水. 切片浸入8.5 g/L NaCl, 0.1 mol/L PBS洗5 min×1次. 30 mL/L H2O2室温10 min消除内源性过氧化物酶. 在40 g/L多聚甲醛/1×PBS中固定15 min. 0.1 mol/L PBS洗5 min×1次. 每片组织滴加20 mg/L的蛋白酶K, 室温下消化30 min, 0.1 mol/L PBS洗5 min×1次. 滴加平衡缓冲液100 μL平衡10 min. 每片组织滴加98 μL平衡缓冲液, 生物素化脱氧核苷酸1 μL, TdT酶混合液1 μL, 4 ℃过夜. 2×SSC浸泡30 min, 终止反应. 0.1 mol/L PBS洗5 min×3次. 1:500稀释链酶亲和素HRP, 滴加100 μL于组织片, 室温下反应20 min, 0.1 mol/ L PBS洗5 min×3次. DAB显色, 显微镜下控制反应时间, 蒸馏水冲洗. 苏木素轻度复染. 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片.

1.2.2 免疫组化检测HSP70的表达: 石蜡切片常规脱蜡入水. 30 mL/L H2O2室温10 min消除内源性过氧化物酶. 抗原热修复: 将切片浸入0.01 mol/ L枸橼酸盐缓冲液中, 微波加热至沸腾, 冷却5 min, 再次加热至沸腾, 冷却. 0.1 mol/ L PBS洗2 min×2次. 滴加正常山羊血清封闭液, 室温20 min. 滴加一抗4 ℃过夜, 0.1 mol/ L PBS洗2 min×3次. 滴加生物素化山羊抗小鼠IgG, 室温15 min, 0.1 mol/ L PBS洗2 min×3次. 滴加SABC室温15 min, 0.1 mol/ L PBS洗5 min×4次, DAB显色, 显微镜下控制反应时间, 蒸馏水冲洗. 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片. 在400倍显微镜下, 同等光强度下, 每张切片随机观察5个视野, 计数每个视野的细胞总数和阳性细胞数, 算出每个视野的阳性率, 5个视野阳性率的均数为此切片的阳性率. HSP70阳性细胞主要表现在: 胞质呈棕黄色, 胞核透明, 少数胞核也呈棕黄色. 胃膜细胞凋亡阳性细胞主要表现为: 胞核固缩, 呈棕黄色.

统计学处理 用SPSS for Windows11.5进行统计分析. 采用均数±标准差mean±SD表示, 组间比较采用方差分析, 两两比较用最小显著性差异法, 相关分析采用Pearson相关, α= 0.05.

2 结果
2.1 胃膜细胞凋亡

在1 mo时段, 各组之间胃黏膜细胞凋亡(图1)率没有显著性差异(P ＝ 0.561); 在2和3 mo时段, 结果显示各组之间的胃黏膜细胞凋亡率差异显著, 两两比较后表明心理应激组胃黏膜细胞凋亡率显著高于对照组, 热应缴组和热应缴加心理应缴组(P <0.05, 表1). 为了了解处理因素与时间因素对胃黏膜细胞凋亡的交互作用, 以胃黏膜细胞凋亡水平为统计指标, 作两因素三水平方差分析方差分析, 结果发现心理应激(F = 9.774, P = 0.003), 热应激(F = 6.025, P = 0.017), 以及热应激和心理应激(F = 4.174, P = 0.046)的交互作用对胃黏膜细胞凋亡有显著作用(P<0.05). 时间因素作用不显著(P>0.05).

表1 各组胃膜细胞凋亡率比较(mean±SD, %).
分组1 mo2 mo3 mo
A: 对照组0.5±0.41.3±1.41.0±1.1
B: 热应激组0.5±0.81.2±1.6a0.4±0.7a
C: 心理应激组1.3±1.23.7±1.94.1±3.9
D: 心理应激加热应激组0.9±1.31.3±1.11.4±1.5
aP<0.05 vs A, B, D组.
图1
图1 处理3 mo胃膜细胞凋亡×200. A: 对照组; B: 热应激; C: 心理应激×100; D: 热应激加心理应激.
2.2胃膜细胞HSP70表达

在1, 2和3 mo时段, 热应激组和热应激加心理应激组的HSP70表达(图2)水平均显著高于对照组和心理应激组(P<0.05, 表2), 而心理应激组与对照组比较差异亦不显著(P>0.05). HSP70诱导表达率的与胃黏膜细胞凋亡率成负相关(r = -0.320, P = 0.008).

表2 各组胃膜细胞HSP70表达水平(mean ± SD, %).
分组1 mo2 mo3 mo
A: 对照组20±1125±1516±9
B: 热应激组64±11a84±13a61±16a
C: 心理应激组34±1546±3033±29
D: 心理应激加热应激组72±6a87±7a65±29a
aP<0.05 vs A, C组.
图2
图2 处理3 mo胃膜细胞HSP70表达. A: 对照组; B: 热应激组; C: 心理应激组; D: 热应激加心理应激组.
3 讨论

我们的研究结果提示心理应激诱发并加重了胃黏膜细胞凋亡. 传统的观念认为胃溃疡发生时细胞是被动的坏死, 但近年来的研究结果表明, 胃黏膜细胞凋亡在胃溃疡发病中有着重要的作用, 并认为胃黏膜细胞凋亡与增生的失衡是溃疡发生的一个重要原因[13]. 已有研究证明心理应激可使胃黏膜表皮增生率被抑制, 并且发现急性胃黏膜损害时胃黏膜细胞凋亡发生率增高[14-16], 这一结果提示热应激对心理应激所致的胃黏膜损伤具有一定的保护作用. 为了了解其保护机制, 我们对应激过程中胃黏膜细胞HSP70的表达进行了观察. 既往的研究已经证明热应激可使细胞内HSP70的表达增加十几倍到几十倍, 主要分布在胞质, 线粒体和细胞核中[17]. 本结果表明, 在实验的各个时段, 热应激组及热应激加心理应激组的HSP70表达水平均显著高于心理应激组. 与热应激组比较, 热应激加心理应激组胃黏膜细胞的HSP70表达水平有升高的趋势, 但无显著性差异, 提示热应激诱导了HSP70表达, 这与以往研究结果一致[17]. 而单纯的心理应激未能引起HSP70表达水平显著升高, 这可能与心理应激的强度、持续时间, 尤其是心理应激后检测的时间有关, 有待于进一步研究. 热应激加心理应激组凋亡率显著低于心理应激组, 经相关分析发现胃黏膜细胞凋亡率与HSP70表达水平呈负相关关系, 即HSP70表达水平越高, 胃黏膜细胞凋亡率越低. 这表明热应激预处理诱导表达的HSP70在心理应激诱导的胃黏膜细胞凋亡中起到了一定的保护作用.

在心理应激过程中, HSP70对细胞的保护可能是通过影响细胞凋亡的通路来起作用[18-19], 并且HSP70还可以发挥分子伴娘的作用, 减少应激诱导的细胞内蛋白质变性和聚集, 使损害的蛋白质重新折叠, 这样一方面维持了受损伤蛋白质的正常结构, 使细胞受到保护. 另一方面变性的蛋白质也启动凋亡程序, HSP70减少应激诱导的蛋白质变性和聚集使变性的蛋白质启动凋亡减少[20].

我们的研究结果表明, 慢性心理应激可诱导或加重胃黏膜细胞凋亡的发生率, 而导致应激性胃溃疡的发生和加重; HSP70在慢性心理应激引起的胃黏膜细胞凋亡中起着一定的保护作用, 提示HSP70在预防心理应激引起的应激性胃溃疡的应用中有较好的前景, 为心身疾病的预防和治疗的供一种新的方向.

编辑:N/A

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