病毒性肝炎 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-11-15; 12(11): 2572-2575
在线出版日期: 2004-11-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i11.2572
乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP12的克隆化
宫嫚, 成军, 纪冬, 刘妍, 郭江, 王建军, 戴久增, 李筠
宫嫚, 成军, 纪冬, 刘妍, 郭江, 王建军, 戴久增, 李筠, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
宫嫚, 女, 1972-11-20生, 辽宁省丹东市人, 满族, 2003年解放军军医进修学院硕士生, 主治医师, 主要从事肝脏疾病的基础研究及临床工作.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队九五科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队十五科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队十五科技攻关项目, No. 01MB135
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2004-05-28
修回日期: 2004-09-13
接受日期: 2004-09-30
在线出版日期: 2004-11-15

目的: 应用基因表达谱芯片技术及生物信息学技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白反式激活新型靶基因, 进一步阐明HBV感染相关性疾病的发病机制.

方法: 以HBV X蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞, 以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照, 提取总RNA进行逆转录, 对产物行基因表达谱芯片分析. 应用分子生物学技术, 结合生物信息学技术, 克隆HBV X反式激活作用的新的靶基因.

结果: 对于所获基因片段序列分析表明, 其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA, 以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列, 并测序证实, 因其可以被X蛋白反式激活, 故命名为X蛋白反式激活蛋白12(XTP12), 已在GenBank中注册, 注册号: AY598792.PS2TP1基因的编码序列全长为731个核苷酸(nt), 编码产物由230个氨基酸残基(aa)组成.

结论: HBV X反式激活新靶基因被成功克隆, 为进一步研究HBV X蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.

关键词: N/A
引文著录: 宫嫚, 成军, 纪冬, 刘妍, 郭江, 王建军, 戴久增, 李筠. 乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP12的克隆化. 世界华人消化杂志 2004; 12(11): 2572-2575
Cloning of human gene XTP12 transactivated by X protein of hepatitis B virus
Man Gong, Jun Cheng, Dong Ji, Yan Liu, Jiang Guo, Jian-Jun Wang, Jiu-Zeng Dai, Jun Li
Man Gong, Jun Cheng, Dong Ji, Yan Liu, Jiang Guo, Jian-Jun Wang, Jiu-Zeng Dai, Jun Li, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of Chinese PLA, Beijing 100039, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. C39970674, No. C03011402, No. C30070689, and Returned Scholarship of General Logistics Department of PLA, No. 98H038
Correspondence to: Jun Cheng,Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of Chinese PLA, 100 Xisihuan Zhong Road, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: May 28, 2004
Revised: September 13, 2004
Accepted: September 30, 2004
Published online: November 15, 2004

AIM: To screen and clone the target gene transactivated by hepatitis B virus (HBV) X protein and to pave the way for further elucidating the pathogenesis of HBV infection.

METHODS: The HBV X coding DNA fragment was amplified with polymerase chain reaction (PCR) technique using pCP10 plasmid containing the full length of HBV genome as the template. The expressive vector of pcDNA3.1-X was constructed by routine molecular biological methods. The HepG2 cells were transfected by pcDNA3.1(-) and pcDNA3.1-X respectively. The total mRNA was isolated and reversely transcribed. The cDNA was analyzed by DNA microarray and then target gene transactivated by hepatitis B virus (HBV) X protein was cloned by molecular biological technique.

RESULTS: After searching for homologous DNA sequences from GenBank, we found that one of the obtained sequences was a new gene with unknown function. Its full length was comfirmed by PCR method. The new gene, amplified from the mRNA of HepG2 cells, consisted of 731 nucleotides (nt) and encoded 230 amino acids, and it was named as XTP12 and registered in GenBank with the accession number AY598792.

CONCLUSION: The target gene is successfully cloned and it will pave the way for further study of the molecular mechanism of the transactivating effects of HBV X protein and the new therapy for chronic hepatitis B.

Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)基因组中最小的开放读码框架(ORF)编码的X蛋白(HBxAg)是一种具有反式激活(transactivation)作用的病毒蛋白, 在HBV感染肝细胞的恶性转化中具有十分重要的作用. HBxAg蛋白不仅对其自身的一些启动子的转录活性具有显著的影响, 而且对其他类型病毒的启动子以及肝细胞的基因启动子也可以产生影响, 改变肝细胞的基因表达谱[1-6]. 为了寻找HBxAg反式激活的新的靶基因, 我们应用基因芯片(DNA microarrays)技术, 对于HBxAg蛋白反式激活作用的靶基因进行筛选, 并应用生物信息学和逆转录PCR(RT-PCR)技术克隆X蛋白反式激活基因12(XTP12), 使进一步研究XTP12蛋白的生物学功能成为可能.

1 材料和方法
1.1 材料

HepG2细胞及感受态大肠杆菌DH5α(本室保存), pcDNA3.1(-)真核表达载体(Invitrogen); FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche), mRNA Purification试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech), T7、SP6通用引物及pGEM-T载体(Promega), 细胞培养试剂(HyClone), DNA序列测定由上海联合基因公司完成.

1.2 方法

以含有2拷贝头尾连接的HBV DNA的质粒pCP10作为模板, 根据ayw亚型的HBV DNA序列设计、合成引物, 进行PCR扩增. 扩增的HBxAg的编码基因首先克隆到TA载体中进行序列测定, 然后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中, 构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBxAg[7]. 肝母细胞瘤细胞系HepG2以DMEM完全培养基培养, 前1 d传代, 75 %融合度的细胞, 应用FuGene 6脂质体转染试剂进行转染, 真核表达载体质粒DNA用量为2 μg. 转染后48 h收获细胞[8-10].

1.2.1 基因芯片技术分析: 应用Trizol试剂盒提取转染细胞的总RNA, 并进行逆转录[11], 进行基因表达谱分析. 包含1152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因和抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 靶基因以0.5 g/L溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样, 杂交及洗涤, 之后应用General Scanning公司的ScanArray 3000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene 3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值, 阳性结果判断: Cy5/Cy3>2.0, 红色荧光, 显示表达增强；Cy5/Cy3<0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱. 对于所获基因片段序列分析表明, 其中之一为新型基因片段.

1.2.2 新基因的PCR扩增与序列分析: 根据电子拼接的新基因序列(731 bp), 利用生物软件Vector NTI设计新基因的序列特异性的含有特异性核酸内切酶EcoR I/BamH I(划线部分)引物(上游引物序列为:5'GAA TTC ACC ACC TGT ATT TCA AAA TG-3', 下游引物序列为: 5'-GGA TCC CTG GTC AGT ACT CTA CTC TG-3'), 利用HepG2细胞来源的mRNA经过RT-PCR扩增所合成的cDNA为模板, 放入9600PCR仪内进行扩增, 条件: 94 ℃预变性2 min; 94 ℃变性1 min, 60 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 35个循环, 再于72 ℃延伸10 min. 扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳获得预期片段, 玻璃奶回收, 并与pGEM-T载体连接, 转化DH5α感受态细菌, 铺于含有氨苄青霉素的LB/X-gal/IPTG培养板上, 37 ℃培养18 h. 挑取白色菌落, 增菌, 使用碱裂解法提取质粒后进行双酶切(EcoR I/BamH I)鉴定, 证明目的基因约731 bp后测序, 进一步鉴定正确后获得阳性克隆.

2 结果

HBV X蛋白真核表达载体的构建及细胞转染经过限制性内切酶消化作图分析, 以及插入基因片段的核苷酸序列分析, 证实构建的真核表达载体正确.

2.1 基因芯片技术分析

经过基因芯片技术分析, 证实转染真核表达载体pcDNA3-HBxAg的HepG2细胞与转染空白载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行比较, 发现HBxAg蛋白上调的靶基因有16种, 下调的靶基因有58种. 其中一个与已知基因没有同源性, 根据生物信息学进行电子拼接, 并考虑真核细胞编码基因Kozak原则及编码区多聚腺苷酸加尾信号, 确定新的基因编码序列.

2.2 新基因的序列分析和克隆化

在16种HBxAg上调的靶基因中, 其中包括未知功能基因, 利用美国国立卫生院(NIH)国立医学图书馆(NLM)国立生物工程中心(NCBI)建立的核苷酸序列数据库(GenBank)及其同源基因序列的搜索(BLASTN), 获得HBxAg蛋白反式激活作用的新型靶基因, 利用生物软件Vector NTI设计引物, 利用HepG2细胞细胞来源的mRNA经过RT-PCR扩增所合成的cDNA为模板, 放入9600PCR仪内进行扩增, 获得该新基因的全长序列, 并测序证实, 此新基因命名为XTP12, 在GenBank中注册, 注册号为AY598792. XTP12基因的编码序列全长为731个核苷酸(nt)(图 1), 编码产物由个氨基酸残基230个(aa)组成(图2).

图2
图2 XTP12的核苷酸序列和编码产物的氨基酸残基序列.
3 讨论

基因芯片可以将极其大量的探针同时固定于支持物上, 所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析, 从而解决了传统核酸印记杂交(southern blotting和northern blotting等)技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量等不足. HBxAg蛋白在病毒复制、肝细胞癌变方面具有十分重要的作用, 可反式激活病毒和细胞启动子进而调节病毒及细胞的转录, 亦可调节细胞癌基因的表达和改变细胞的生长特性[12-13]. HBxAg蛋白的奇特之处在于: 结构简单, 但却具有广泛的反式激活作用. Nakatake et al[14]对X基因的反式激活进行研究, 结果为X基因终止密码子变异的HBV基因组转染HepG2后, 病毒的复制水平下降; 当与野生型Ｘ基因共转染时, 病毒的复制水平将会得到恢复. Renner et al[15]用含HBV增强子、C区启动子及CAT报告基因的质粒与X基因重组表达质粒共转染肝癌细胞PLC/PRF/5, 同样也发现X基因可反式激活HBV增强子. HBxAg蛋白不仅可以上调HBV基因的复制能力, 还可以影响细胞转录、生长以及细胞凋亡[16]. 目前认为HBxAg蛋白广泛的激活作用是由于其具有双重作用途径. HBxAg蛋白在细胞内定位于细胞质和核内[17], 对HBxAg反式激活途径目前研究认为存在两种方式, 即: 在胞质中通过信号传导途径, 如: Ras-Raf-MAPK级连反应调节基因的表达[18-20] ; 在核内与TATA结合蛋白等相互作用而影响基因的表达. HBxAg蛋白还可以直接激活Src酪氨酸蛋白激酶的活性, Src激酶被激活后能刺激Ras-Raf-MAKP传导通路, 促进c-Fos和c-Jun的合成, c-Fos和c-Jun以异二聚体的方式组成AP-1, AP-1直接结合序列特异的AP-1启动子上游反应元件, 使转录水平上调. HBxAg蛋白细胞同时定位于胞质、胞核及其两种相对独立的反式激活途径, 使其在HBV感染、HBV相关肝癌的发生和发展方面处于十分重要的地位, 对其反式激活途径、方式进行深入的研究, 有助于了解HCC发病机制, 并对相应的治疗提供新的方法.

关于HBxAg的反式调节作用、对于肝细胞基因表达谱的影响等的研究还只能说刚刚开始, 目前对于新克隆的HBxAg蛋白反式激活的靶基因的结构与功能、表达与调控, 以及新基因的生物学作用和在乙型肝炎致病机制中的作用和地位不明, 需要进一步研究, 以阐明新基因的研究意义[21-22]. 但是我们相信, HBxAg反式调节的一种新型靶基因XTP12基因的克隆为研究HBxAg的生物学功能开辟了新的方向. 对XTP12生物学和医学意义的研究, 必将促进在HBV感染后对HBxAg作用机制研究的深入.

编辑:N/A

1.  刘 妍, 成 军, 陆 荫英, 李 克. 乙型肝炎病毒蛋白反式激活基因的研究. 世界华人消化杂志. 2002;10:217-219.  [PubMed]  [DOI]
2.  李 克, 王 琳, 成 军, 陆 荫英, 洪 源, 刘 妍, 张 玲霞. 乙型肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究. 世界华人消化杂志. 2002;10:213-215.  [PubMed]  [DOI]
3.  洪 源, 成 军. 肝炎病毒DNA疫苗的研究. 世界华人消化杂志. 2002;10:221-222.  [PubMed]  [DOI]
4.  李 克, 王 琳, 成 军, 陆 荫英, 张 玲霞, 李 莉, 刘 妍, 段 惠娟. 丙型肝炎病毒NS2基因酵母双杂交"饵"载体构建及表达. 世界华人消化杂志. 2002;10:129-132.  [PubMed]  [DOI]
5.  韩 萍, 刘 妍, 成 军, 王 刚, 陆 荫英, 李 克, 李 莉. 截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白上调c-myc基因表达的研究. 世界华人消化杂志. 2002;10:141-144.  [PubMed]  [DOI]
6.  李 克, 王 琳, 成 军, 陆 荫英, 洪 源, 刘 妍, 张 玲霞. 丙型肝炎病毒蛋白结合蛋白. 世界华人消化杂志. 2002;10:215-217.  [PubMed]  [DOI]
7.  刘 妍, 董 菁, 成 军, 夏 小兵, 李 克, 王 琳, 施 双双, 段 惠娟, 杨 继珍. 乙肝病毒X基因在真核细胞中的表达及反式激活SV40病毒早期启动子的研究. 解放军医学杂志. 2001;26:404-406.  [PubMed]  [DOI]
8.  柯 亨宁, 斯 崇文, 成 军, 于 敏, 刘 丹. HBsAg及其与小鼠白介素-18融合蛋白表达质粒的构建和DNA免疫. 中华传染病杂志. 2001;19:77-80.  [PubMed]  [DOI]
9.  成 军, 李 莉. 胸腺素a1在慢性病毒性肝炎治疗中的应用. 国外医学病毒学分册. 2001;8:55-59.  [PubMed]  [DOI]
10.  董 菁, 成 军, 王 勤环, 施 双双, 洪 源, 皇甫 竞坤, 王 刚, 李 莉, 斯 崇文. 乙型肝炎病毒逆转录酶区基因序列准种与变异研究. 解放军医学杂志. 2001;26:823-825.  [PubMed]  [DOI]
11.  皇甫 竟坤, 董 菁, 邓 红, 成 军, 施 双双, 洪 源, 任 喜民, 李 莉. 乙型肝炎病毒核心基因启动子序列突变及准种. 世界华人消化杂志. 2001;9:1323-1325.  [PubMed]  [DOI]
12.  成 军, 董 菁, 刘 妍, 李 莉, 斯 崇文, 王 勤环, 张 玲霞, 陈 菊梅. 乙型肝炎病毒准种研究的临床意义. 世界华人消化杂志. 2002;10:209-221.  [PubMed]  [DOI]
13.  成 军, 刘 妍, 陆 荫英, 李 克, 王 琳. 乙型肝炎病毒对细胞信号转导的影响. 世界华人消化杂志. 2003;11:472-474.  [PubMed]  [DOI]
14.  Nakatake H, Chisaka O, Yamamoto S, Matsubara K, Koshy R. Effect of X protein on transactivation of hepatitis B virus promoters and on viral replication. Virology. 1993;195:305-314.  [PubMed]  [DOI]
15.  Renner M, Haniel A, Bürgelt E, Hofschneider PH, Koch W. Transactivating function and expression of the x gene of hepatitis B virus. J Hepatol. 1995;23:53-65.  [PubMed]  [DOI]
16.  陆 荫英, 李 克, 成 军, 王 琳, 刘 妍, 段 惠娟, 张 玲霞. 乙型肝炎病毒X基因酵母表达载体构建及表达. 世界华人消化杂志. 2002;10:15-18.  [PubMed]  [DOI]
17.  Henkler F, Hoare J, Waseem N, Goldin RD, McGarvey MJ, Koshy R, King IA. Intracellular localization of the hepatitis B virus HBx protein. J Gen Virol. 2001;82:871-882.  [PubMed]  [DOI]
18.  Tarn C, Lee S, Hu Y, Ashendel C, Andrisani OM. Hepatitis B virus X protein differentially activates RAS-RAF-MAPK and JNK pathways in X-transforming versus non-transforming AML12 hepatocytes. J Biol Chem. 2001;276:34671-34680.  [PubMed]  [DOI]
19.  Nijhara R, Jana SS, Goswami SK, Rana A, Majumdar SS, Kumar V, Sarkar DP. Sustained activation of mitogen-activated protein kinases and activator protein 1 by the hepatitis B virus X protein in mouse hepatocytes in vivo. J Virol. 2001;75:10348-10358.  [PubMed]  [DOI]
20.  Nijhara R, Jana SS, Goswami SK, Kumar V, Sarkar DP. An internal segment (residues 58-119) of the hepatitis B virus X protein is sufficient to activate MAP kinase pathways in mouse liver. FEBS Lett. 2001;504:59-64.  [PubMed]  [DOI]
21.  成 军. 新基因结构与功能研究的策略. 世界华人消化杂志. 2003;11:373-377.  [PubMed]  [DOI]
22.  成 军, 刘 妍, 陆 荫英, 李 克, 王 琳. 生物信息学技术与新基因的研究. 世界华人消化杂志. 2003;11:474-477.  [PubMed]  [DOI]