胃癌 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-11-15; 12(11): 2551-2554
在线出版日期: 2004-11-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i11.2551
瞬时转染CD44反义寡核苷酸抑制人胃癌MGC80-3细胞增生并诱导凋亡
荆雪宁, 张玲, 王芸, 毛海婷, 温培娥, 李登华, 崔树龄, 顾洪涛
荆雪宁, 张玲, 王芸, 毛海婷, 温培娥, 李登华, 崔树龄, 顾洪涛, 山东省医学科学院基础医学研究所免疫室 山东省济南市 250062
荆雪宁, 女, 1978-02-09生, 山东省莱州市人, 汉族, 山东省医学科学院硕士研究生.
基金项目: 山东省医药卫生科研项目资助, No. 2003-139
通讯作者: 张玲, 250062, 山东省济南市经十路89号, 山东省医学科学院基础医学研究所免疫室. zhlnln@163.net
电话: 0531-2919933
收稿日期: 2004-07-12
修回日期: 2004-08-20
接受日期: 2004-09-04
在线出版日期: 2004-11-15

目的: 研究CD44反义寡核苷酸(CD44ASODN)对人胃癌MGC80-3细胞的增生抑制和诱导凋亡的作用和机制.

方法: 设计并合成CD44ASODN, 脂质体介导转入MGC80-3胃癌细胞, 采用流式细胞术(FACS)检测CD44、Fas的表达及细胞凋亡; RT-PCR法检测CD44mRNA的表达; MTT法检测细胞增生.

结果: CD44ASODN(1.6 μmol/L)明显地抑制MGC80-3细胞CD44mRNA和蛋白表达水平. CD44ASODN作用MGC80-3细胞48 h后, 细胞的增生呈现明显的抑制作用, 其抑制率为31.0%, 72, 96 h的抑制率分别为46.3%、49.6%(P<0.01), 其增生抑制作用呈时间依赖效应. 在CD44配体低分子质量透明质酸存在的环境中, CD44ASODN能显著增高细胞表面Fas分子的表达, 表达率从6.7%提高为16.8%(P<0.01), 并显著地增加MGC80-3细胞对FasmAb诱导凋亡的敏感性, 凋亡率从0增加到26.5%(P<0.01).

结论: CD44反义寡核苷酸通过抑制MGC80-3细胞CD44m RNA和蛋白表达, 抑制MGC80-3细胞的增生, 增高细胞表面Fas的表达及MGC80-3细胞对FasmAb诱导凋亡的敏感性, 逆转胃癌细胞的免疫逃逸作用.

关键词: N/A
引文著录: 荆雪宁, 张玲, 王芸, 毛海婷, 温培娥, 李登华, 崔树龄, 顾洪涛. 瞬时转染CD44反义寡核苷酸抑制人胃癌MGC80-3细胞增生并诱导凋亡. 世界华人消化杂志 2004; 12(11): 2551-2554
Inhibitory and apoptosis-inducing effects of CD44 antisense oligodeoxyribonucleotides on human gastric cancer cell line MGC80-3
Xue-Ning Jing, Ling Zhang, Yun Wang, Hai-Ting Mao, Pei-E Wen, Deng-Hua Li, Shu-Ling Cui, Hong-Tao Gu
Xue-Ning Jing, Ling Zhang, Yun Wang, Hai-Ting Mao, Pei-E Wen, Deng-Hua Li, Shu-Ling Cui, Hong-Tao Gu, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Science, Jinan 250062, Shandong Province, China
Supported by: Shandong Medical Research Project, No. 2003-139
Correspondence to: Dr. Ling Zhang, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Science, 89 Jingshi Road, Jinan 250062, Shandong Province, China. zhlnln@163.net
Received: July 12, 2004
Revised: August 20, 2004
Accepted: September 4, 2004
Published online: November 15, 2004

AIM: To study the role and mechanism of antisense oligodeoxyribonucleotides (ASODN) on proliferation and apoptosis of MGC80-3 cells.

METHODS: Flow cytometry was used to detect CD44, Fas expression and apoptosis of MGC80-3 cells. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay was used to examine CD44 mRNA level; MTT assay was used to detect cell proliferation.

RESULTS: CD44 mRNA and CD44 protein expression in MGC80-3 cells was blocked and down-regulated after transfected with CD44ASODN (1.6 μmol/L). CD44ASODN inhibited the growth of MGC80-3 cells with depression ratios of 31.0%, 46.3% (P < 0.01), and 49.6% (P < 0.01) at 48 h, 72 h, and 96 h respectively in a time-dependant manner. With the existence of hyaluronic acid, CD44ASODN improved Fas expression in MGC80-3 cells from 6.7% to 16.8% (P < 0.01). At the same time, it enhanced the susceptibility of MGC80-3 cells to Fas mAb and the apoptotic rate of the cells increased from 0% to 26.5% (P < 0.01).

CONCLUSION: CD44ASODN can down-regulate the expression of CD44 mRNA and protein, inhibit MGC80-3 cell proliferation and promote apoptosis induced by Fas mAb.

Key Words: N/A
0 引言

黏附分子CD44以细胞特异性的方式表达于许多细胞表面, 在细胞黏附、信号传导及调节细胞迁移等过程中发挥重要作用. 肿瘤细胞表面的CD44表达显著增高, 或表达CD44异构体的独特模式, 与肿瘤的发生、发展与远处侵袭转移关系密切, 是人类肿瘤转移和预后不良的标志. 最新研究表明, CD44与其细胞外基质配体低分子质量透明质酸结合后, 促进肿瘤细胞的增生, 降低肿瘤细胞表面Fas的表达, 通过Fas/FasL途径降低肿瘤细胞对CTL的敏感性, 进而使肿瘤逃脱Fas介导的CTL杀伤[1]. 我们通过设计合成CD44反义寡核苷酸(ASODN), 封闭和抑制人低分化黏液腺胃癌MGC80-3细胞CD44表达, 阐明CD44ASODN对MGC80-3细胞增生能力、Fas的表达及FasmAb诱导凋亡的影响, 为CD44基因的肿瘤生物治疗, 提供新的理论和实验依据.

1 材料和方法
1.1 材料

MGC80-3细胞株, 由本室保存; RPMI1640、胰蛋白酶, 为GIBCO产品; 鼠抗人CD44(HCAM)、兔抗人Fas多克隆抗体, 为Santa Cruz公司产品; FITC标记的羊抗兔IgG抗体、兔抗鼠IgG抗体购自华美生物公司; PI, HA, MTT为Sigma公司产品; 鼠抗人FasmAb(AM01L)为Oncogene公司产品; 脂质体(OligofectamineTM)为Invitrogen公司产品; TRIZOL Reagent为Invitrogen公司产品; oligo(dT)18, Rnasin为上海生工生物工程技术服务有限公司产品. 逆转录试剂为Promega公司产品; PCR试剂, 为宝生物工程有限公司产品.

1.2 方法

1.2.1 反义寡核苷酸合成、脂质体介导和转染MGC80-3细胞[2-3]: CD44反义寡核苷酸序列与CD44 mRNA的5'端非编码区互补. CD44正反义寡核苷酸序列: 反义(ASODN): 5'-GCGCGGGCGAAAGG-AGCT-3', 正义(SODN)5'-TCCGGACACCATGGACAAG-3', 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成, 并进行了硫代化修饰. 采用脂质体(OligofectamineTM, Invitrogen公司产品)介导法, 形成CD44ASODN、SODN脂质体复合物(CD44A/SODN-OF). 取对数生长期的MGC80-3细胞5×105/孔接种6孔板, 待细胞密度增至30-50%时, 加入不同浓度CD44A/SODN-OF转染, 实验分组: (1)对照组; (2)ASODN处理组(0.8, 1.2, 1.6×10-3 mmol/L); (3)SODN处理对照组(0.8, 1.2, 1.6×10-3 mmol/L), 37 ℃, 50 mL/L CO2培养4 h后弃转染液, 加入新鲜培养液继续培养24 h, 48 h, 72 h.

1.2.2 流式细胞术检测MGC80-3细胞CD44分子表达: 收集处理72 h的对照组, ASODN组(1.6×10-3 mmol/L), SODN组(1.6×10-3 mmol/L)MGC80-3细胞(>106), 参照文献[4-5]进行检测.

1.2.3 RT-PCR法检测MGC80-3细胞CD44mRNA表达[6]: 收集处理48 h的1.2.2述各组MGC80-3细胞(>106), 按TRIZOL Rengent说明, 提取总RNA, 定量后进行RT-PCR. DNA扩增产物以β-actin基因作内参照, 采用Gel Dos1000凝胶分析仪扫描分析并相对定量.

1.2.4 流式细胞术检测Fas分子的表达[7-8] 和细胞凋亡[9-11]: 实验分组中另设未处理对照(对照1)组, 在上述对照(对照2)组、处理组细胞24 h转染后, 加入CD44配体低分子质量透明质酸(简称HA)终浓度为0.1 g/L, 刺激24 h后收集细胞, 检测Fas分子的表达. 向转染和加入HA刺激24 h后的各组和对照1组中加入鼠抗人FasmAb终浓度为2 mg/L, 继续作用24 h后收集细胞, 检测细胞凋亡.

1.2.5 MTT法检测细胞增生[12-13]: 取对数生长期的MGC80-3细胞5×107/L接种于96孔板, 37 ℃, 50 mL/L CO2孵育过夜, 各组细胞转染和加入HA后, 继续培养24, 48, 72, 96 h. 终止培养前4 h加入MTT(5 g/L), 4 h后置酶标仪下测定.

统计学处理 采用SPSS10.0 for Windows统计软件进行χ2检验、t检验, 确定P<0.05为差异有显著性统计学意义.

2 结果
2.1 MGC80-3细胞CD44分子的表达

0.8, 1.2, 1.6×10-3 mmol /L CD44ASODN作用于MGC80-3细胞72 h后, 细胞表面CD44蛋白的表达较对照组和SODN对照组显著下降(P = 0.0 001<0.01, 表1), 1.6×10-3 mmol/L作用后, 自48 h, 72 h后CD44蛋白表达显著下降(P = 0.0 001<0.01, 表2), 呈现出剂量和时间依赖效应.

表1 不同剂量CD44A/SODN-OF处理后MGC80-3 CD44分子阳性细胞的变化.
Dose(×10-3 mmol/L)CD44+cell(/10 000)CD44expression(%)
Control8 68086.80
ASODN 0.85 34553.45b
SODN 0.89 44994.49
ASODN 1.23 89738.97b
SODN 1.29 52395.23
ASODN 1.63 43934.39b
SODN 1.68 20582.05
bP<0.01 vs Control.
表2 CD44A/SODN-OF处理MGC80-3细胞后不同时间CD44分子阳性细胞的变化.
Time(h)CD44+cell(/10 000)CD44 expression(%)
Control 248 99689.96
ASODN 249 55195.51b
SODN 249 87698.76
Control 488 94989.49
ASODN 484 41944.19b
SODN 489 82498.24
Control 728 68086.80
ASODN 723 83738.37b
SODN 729 52995.29
bP<0.01 vs Control.
2.2 MGC80-3细胞CD44mRNA表达水平

在2, 3, 4泳道中清晰可见位于318 bp处的β-actin和482 bp处的CD44片段(图1), 与对照组和SODN对照组相比, ASODN组的CD44基因表达下降, 相对定量值由1.09降至0.14, 表明CD44mRNA基因的表达受到抑制.

图1
图1 CD44基因的RT-PCR扩增片段电泳结果. 1: Marker; 2: ASODN; 3: SODN; 4: Control.
2.3 MGC80-3细胞Fas分子的表达

在HA的刺激下, MGC80-3细胞表面Fas分子表达下降, 由对照1组的21.7%降至对照2组的6.7%(P = 0.0 001<0.01), CD44ASODN作用后, 与SODN组和对照2组相比, ASODN组Fas分子表达率显著增高, 由6.7%升至16.8%(P = 0.0 001<0.01). 表明用CD44ASODN封闭CD44的表达后, 可显著地提高由HA诱导下降的Fas分子的表达(表3).

表3 CD44A/SODN-OF处理48 h后MGC80-3细胞Fas阳性细胞的变化.
GroupDose(×10-3 mmol/L)Fas+cell number(/10 000)Fas expression(%)
Control 12 16921.7
Control 26696.7b
ASODN1.61 68116.8d
SODN1.61 14311.4
bP<0.01 vs Control 1组;
dP<0.01 vs Control 2组.
2.4 Fas单抗诱导MGC80-3细胞凋亡

对照组未检测到凋亡, 而48hASODN处理组细胞的凋亡率为26.6%, 显著高于SODN组(10.4%)和对照组(0).

2.5 MGC80-3细胞增生活性

CD44ASODN处理48 h后的MGC80-3细胞, 在HA存在下, 与SODN组和对照组相比, 生长明显受到抑制, 48, 72和96 h的抑制率分别为31.0%、46.3%、49.6%(P = 0.0 001<0.01), 并呈时间依赖效应(图2).

图2
图2 CD44A/SODN-OF对MGC80-3细胞增生的影响.
3 讨论

肿瘤细胞表面常发生CD44表达显著增高, 或表达CD44异构体的独特模式, 与肿瘤的发生、发展与远处侵袭转移关系密切, 是人类肿瘤转移和不良预后的标志. 最新研究表明, CD44可以通过多种途径参与肿瘤的免疫逃逸, 其中最重要的就是抑制肿瘤细胞凋亡和促进肿瘤细胞增生. Yasuda et al发现肺癌细胞过高表达的CD44与其细胞外基质配体低分子质量透明质酸结合后, 降低肺癌细胞表面Fas的表达, 通过Fas/FasL途径降低肺癌细胞对CTL的敏感性, 进而使肺癌细胞逃脱CTL细胞通过FasL/Fas介导的凋亡[1]. 我们在实验中用CD44配体低分子质量HA刺激24 h后, 人低分化黏液腺胃癌MGC80-3细胞Fas分子表达率由21.7%降至6.7%, 采用体外Fas/FasL途径诱导凋亡的研究发现, 用FasmAb作用24 h后, MGC80-3细胞不出现凋亡, 同时细胞的增生活性高, 在体外观察到了胃癌细胞的免疫逃逸作用. 为了抑制胃癌细胞增生和诱导凋亡, 我们设计合成CD44ASODN, 转入高表达CD44的人低分化黏液腺胃癌MGC80-3细胞中. 结果表明, CD44ASODN封闭和抑制了MGC80-3细胞CD44 mRNA和蛋白表达, 且抑制作用呈时间和剂量依赖效应. 用CD44ASODN处理MGC80-3细胞后, 加入HA作用, 细胞的Fas表达显著增高, 由下降的6.7%上升到16.8%. 同时, 体外Fas/FasL途径诱导凋亡的研究发现, 加入鼠抗人FasmAb作用24 h后, CD44ASODN处理组细胞出现细胞凋亡, 其凋亡率为26.6%, 显著高于未处理对照组. 可见, 用CD44ASODN抑制CD44基因的表达后, 可以显著地提高由HA诱导下降的Fas分子的表达, 并显著增加FasmAb诱导凋亡的敏感性.

大量研究表明, 在肿瘤组织中, 随着肿瘤的进展, CD44表达强度明显增加[14-16]. 因此, CD44的表达强度可以作为肿瘤预后不良的标志[17-18]. 在良性肿瘤中, CD44的表达呈现同质性, 而在恶性黑素瘤中, CD44主要集中于肿瘤的边缘, 促进肿瘤的增生和扩散[19-20]. CD44分子的高表达促进肿瘤细胞的增生[21], 增生能力的提高又促进CD44分子的表达[22-23]. CD44与其配体HA结合之后, 引发细胞间Ca2+流动, 促进细胞的增生[24-26]. 我们用1.6×10-3 mmol/LCD44ASODN作用于MGC80-3细胞24 h后, 向培养液中加入HA继续作用24, 48, 72, 96 h, 发现CD44ASODN处理组较对照组具有明显的增生抑制作用, 且呈时间依赖性, 与CD44ASODN显著抑制CD44mRNA和蛋白的表达相一致, 因此表明, MGC80-3细胞的增生抑制可能是反义基因封闭CD44基因的表达所致. 肿瘤细胞最基本的特征是无限制增生和凋亡抵抗. 我们发现, 用CD44反义寡核苷酸阻断CD44的表达后, 一方面抑制MGC80-3细胞的增生能力, 另一方面增加MGC80-3细胞表面Fas的表达, 增加MGC80-3细胞对FasmAb诱导凋亡的敏感性, 提示CD44基因有可能成为肿瘤生物治疗的靶点.

编辑:N/A

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