新生鼠肠损伤时肝脏黄嘌呤氧化酶的变化

摘要

目的: 探讨新生鼠肠损伤时肝脏黄嘌呤氧化酶(XO)的变化.

方法: 新生大鼠随机分为对照组8只, 实验组每一时相点各8只. 将E coli O₅₅: B₅脂多糖5 mg/kg 注入新生鼠胃内, 分别于灌胃后3, 6, 12, 24, 72 h处死动物. 取部分肝组织固定, 包埋, HE染色, 光镜下观察其组织学改变. 其余肝组织用于测定XO活性.

结果: 实验组6, 12 h XO活性明显高于对照组(分别为4 719±793 nkat/g vs 3 961±387 nkat/g, 4 929±477 nkat/g vs 3 961±387 nkat/g, P <0.05); 3, 24, 72 h XO活性与对照组无显著差异(P <0.05). 内毒素治疗后随着时间的进行逐渐出现中央静脉扩张, 肝窦充血、炎性细胞浸润, 肝细胞水肿, 胞质疏松, 空泡变性. 6, 12 h可见大量肝细胞内出血, 肝细胞坏死. 24, 72 h肝细胞水肿渐消失, 出血坏死不明显.

结论: 新生鼠肠损伤时可致肝脏受累, 且XO活性愈高, 肝损伤愈重.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: July 20, 2004
Revised: August 9, 2004
Accepted: September 4, 2004
Published online: October 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis, NEC)是新生儿期最常见的胃肠道疾病, 可导致多器官功能衰竭[1]. 肝脏是人体重要的免疫器官, 在肠屏障功能受损时, 作为第一道防线, 一定程度上能抑制肠源性感染扩散, 但其本身炎性细胞也可被激活, 在倍增全身炎症反应的同时自身亦受到损伤[2].我们通过内毒素(lipopolysaccharide, LPS)建立新生鼠肠损伤模型, 探讨肝脏黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XO)的变化及意义.

1 材料和方法

1.1 材料

健康1日龄Wistar新生大鼠, 平均体质量6.3±0.9 g, 由中国医科大学第二临床学院动物部提供. 随机分为对照组8只, 实验组每一时相点(3, 6, 12, 24, 72 h)各8只. 将1.9F硅胶管(B-D Inc, Sandy, UT, USA)经口插入胃内, E coli O₅₅: B₅脂多糖(LPS;Sigma Chemical CO．, St．Louis, Mo) 5 mg/kg用无菌生理盐水稀释至0.2 mL注入胃内; 对照组则注入无菌生理盐水0.2 mL[3]. 灌胃后各组均放回母鼠旁, 继续哺乳, 直至实验结束.动物处死后, 分离肝脏.取肝组织于40 g/L多聚甲醛中固定, 常规脱水, 包埋切片, 行HE染色, 光镜下观察其组织学变化. 其余肝组织于－80 ℃超低温冰箱中保存, 以备检测.

1.2 方法

肝组织XO活性测定, 按测定试剂盒要求, 应用紫外/可见分光光度计(法国500-P型), 测定肝组织匀浆XO活性. 同时按考马斯亮兰蛋白测定试剂盒说明测定每一样本的蛋白浓度. 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所.

统计学处理 经SPSS 11.5 For Windows数据分析软件处理. 所有数据以mean±SD表示, 组间比较采用配对t检验. 统计结果显著性以P <0.05表示.

2 结果

2.1 肝组织XO活性变化

实验组6, 12 h肝组织XO活性(4 719±793 nkat/g, 4 929±477 nkat/g)均明显高于对照组(3 961±387 nkat/g, P <0.05), 高峰在12 h; 24 h (4 481±473 nkat/g) XO活性下降, 3(4 268±455 nkat/g), 24, 72 h (3 994±605 nkat/g)肝组织XO活性与对照组无显著差异(P >0.05).

2.2 肝组织形态学改变

对照组新生鼠肝小叶分界不清, 肝板排列较成年大鼠差, 胞质嗜碱性, 门管区不清楚, 但中央静脉清晰可见. 内毒素治疗后随着时间的进行, 逐渐出现中央静脉扩张, 肝窦充血、炎性细胞浸润, 肝细胞水肿, 胞质疏松, 空泡变性. 6, 12 h时可见大量肝细胞内出血, 肝细胞坏死. 24, 72 h时肝细胞水肿渐消失, 出血坏死不明显.

3 讨论

NEC多见于新生儿. 早产、缺氧/缺血、肠道喂养和细菌增生是导致此病的主要危险因素[1,3-5]. 临床统计, 80%以上的NEC患儿是早产儿或低出生体质量儿, 其发病率与胎龄呈负相关[6-8], 原因是早产儿肠道免疫功能不成熟. 胃肠道免疫功能分为非特异性(先天性)和特异性两部分, 前者包括胃酸、蛋白水解酶、粘蛋白及通透性等[9]. 生理功能完整的肠黏膜对细菌和内毒素构成屏障作用; 在感染和创伤等应激状况下, 肠屏障受损, 大量细菌和毒素经门静脉和肠系膜淋巴系统进入体循环, 导致肠源性内毒素血症和细菌移位, 并可引发炎症连锁反应, 引起全身炎症反应综合征, 最终致多器官功能衰竭(MOF)[2]. 因此有人称肠道为"创伤后多器官功能衰竭的源泉". NEC亦可导致多器官功能衰竭.

新生鼠非特异性免疫功能缺陷[3], 我们发现, 在肠道给予LPS后肝组织渐出现中央静脉扩张, 肝窦充血、炎性细胞浸润, 肝细胞水肿, 胞质疏松, 肝细胞出血、坏死等自身受损的表现. LPS可增加肠黏膜通透性、改变肠动力、降低肠防御机能、损害肠上皮细胞紧密连接从而促进肠道细菌移位. 而肝脏是人体的主要代谢器官, 也是重要的免疫器官. 生理条件下, 肝肠形成肠肝轴(enterohepaticaxis), 发挥多种生理功能. 在肠屏障功能受损时, LPS进入循环系统, 则肝脏炎性细胞可被源自肠道的细菌和毒素激活, 出现肝细胞坏死[3,10].

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是造成肝损伤的重要因素. 黄嘌呤脱氢酶/黄嘌呤氧化酶(xanthine dehydrogenase/ xanthine oxidase, XD/XO)系统是肝脏ROS的主要来源[11]. XD是XO的前体, 二者既独立存在又可相互转化. XD和XO均可催化次黄嘌呤向黄嘌呤及黄嘌呤向尿酸的转化. 不同的是XD需NAD+作为电子受体, 产生稳定的活性产物NADPH; 而XO则以分子氧为电子受体, 产生高活性超氧阴离子(O.₂^-)和过氧化氢(H₂O₂). 正常情况下, XD占酶活性的90%, 仅10%以XO形式存在. 主要参与核酸的分解代谢; 促进肠道对铁的吸收和转运; 而且, 当细菌或毒素侵袭导致毛细血管内皮轻微受损时, XD从血管内皮细胞释出, 在有氧环境中转变为XO, 在催化底物过程中产生O₂^-, 对机体具有防御功能[12-13]. 但在缺血/再灌注或感染时, 细胞内ATP分解过度, ATP不足使钙泵活性下降, 细胞内Ca²⁺浓度升高, 激活钙依赖蛋白酶, 促使XD向XO转化, XO活性显著增加, ROS代谢产物亦增加. 介导脂质过氧化反应, 使膜受体、蛋白酶和离子通道的微环境发生改变, 导致细胞功能障碍, 甚至死亡[10-12]. 我们发现, 经LPS治疗后, 肝组织XO活性愈高, 肝损伤愈重. 72 h时XO活性降低, 肝细胞水肿消失, 出血坏死不明显.提示临床如能应用XO抑制剂有效减少活性氧的产生, 对于新生儿NEC的整体治疗可能具有一定意义.

备注

$[Footnotes]

参考文献

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