食管癌p53基因第5外显子突变影响因素的病例对照研究

摘要

目的: 探讨p53基因第5外显子基因突变的影响因素.

方法: 应用DNA序列分析技术和病例对照研究方法, 分析西安和林州食管癌p53基因第5外显子的突变情况及其影响因素.

结果: 西安和林州p53基因第5外显子突变率分别为14.3%(6/42)和18.6%(8/43), 两地突变率比较差异无显著性. 西安不经常食用新鲜蔬菜者突变率(37.5%)显著高于经常食用新鲜蔬菜者(8.8%, P<0.05), P=6.20(0.97-39.7). 林州食用酸菜者突变率(38.5%)显著高于不食用酸菜者(17.1%, P<0.05), P=5.63(1.10-28.84). 其余因素与p53基因第5外显子突变未见显著性差异.

结论: 在西安经常食用新鲜蔬菜可减少p53基因第5外显子突变发生, 在林州经常食用酸菜可增加p53基因第5外显子突变的机率.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: July 23, 2004
Revised: August 9, 2004
Accepted: August 25, 2004
Published online: October 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

p53基因作为食管癌发生发展过程中的重要分子学变化已被多项研究证实[1-3]. 对p53基因突变谱的分析有助于从分子水平探索危险因素引起肿瘤的机制[4-6]. 如在肺癌p53基因突变中G→T颠换较多见, 据认为与烟草中的苯并芘有关[7]; 肝癌中p53基因第7外显子249密码子的改变多发生在曾经食用被黄曲霉菌B1污染的粮食病例[8]. 众所周知, 食管癌存在着显著的地理分布差异, 也就是说外源性致癌物在各地暴露的程度可能不同, 分析不同地区基因水平的改变是否能揭示造成这种差异的原因? 为此我们对属于食管癌高发区的河南省林州和中发区的西安食管癌组织p53基因第5外显子基因突变进行了病例病例对照研究.

1 材料和方法

1.1 材料

分别选择西安(42例)和林州(43例)某综合性医院入院治疗的新发食管癌病例, 为连续病例, 均经病理学确诊, 术前未进行化疗和放疗, 且在当地居住20年以上. 由研究者按统一制订的调查表直接询问患者本人, 多在术前进行. 调查内容包括一般人口学特征(年龄、性别、职业和文化程度等)、烟酒嗜好、饮食习惯(食用酸菜、水果和新鲜蔬菜摄入情况、热烫饮食等)和食管癌家族史等.

1.2 方法

标本取自手术切除的癌组织, 捣碎, 蛋白酶K消化, 37 ℃过夜, 常规酚: 氯仿抽提DNA. PCR扩增目的基因片段, p53第5外显子引物序列为P1: 5'-GTT TCT TTG CTG CCG TGT TC-3'; P2: 5'-AGG CCT GGG GAC CCT GGG CA-3', 扩增片段长度为323 bp[2]. PCR反应条件为: 反应总体积100 mL, 其中含引物25 pmol/L各1 mL, 10 nmol/L4×dNTP6 mL, 10×Buffer25 mmol/L 10mL, 25 mmol/LMgCL₂ 4 mL, 模板DNA0.1-0.5 mg, Taq酶3U.94 ℃预变性5 min后加Taq酶3 U, 94 ℃1 min, 66 ℃1 min, 72℃1 min, 35个循环后于72 ℃延伸10 min, 取8 mL产物在20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下照相分析. PCR产物纯化回收, 应用ABI基因测序分析仪(ABI公司)完成DNA序列检测.

统计学处理 建立Foxbase数据库, 将所有调查表信息核对无误后录入微机备用. 首先对西安和林州病例的年龄、性别进行均衡性检验. 然后进行单因素分析, 计算χ², OR及OR95%CI. 所有数据处理采用SPSS10.0软件完成.

2 结果

2.1 西安与林州食管癌p53基因第5外显子突变率比较

西安和林州食管癌标本p53基因第5外显子DNA序列测定结果显示, 西安42例标本中有6例(6个位点)发生突变, 突变率为14.3%; 林州43例食管癌标本中, 有8例10个位点发生突变, 其中有2例各检出2种突变, 突变率为18.6%, 两地突变率比较无显著性差异(χ² = 0.28, P=0.59).

2.2 病例病例对照研究

按年龄(<60岁和≥60岁)、性别分组比较, 西安和林州p53基因第5外显子突变病例在<60岁和≥60岁组, 男性和女性组间分布均未见显著性差异(P >0.05, 表1).

表1 西安和林州p53基因第5外显子突变与无突变病例年龄和性别分布.

因素	西安市				林州市
	突变	未突变	χ2	P	突变	未突变	χ2	P
<60 yr	2	17			4	22
≥60 yr	4	19	0.40	0.53	4	13	0.45	0.50
男	4	30			7	28
女	2	6	0.93	0.34	1	15	1.57	0.21

西安吸烟、饮酒、食用酸菜和食管癌家族史等食管癌主要危险因素与p53基因第5外显子突变无显著性联系(P >0.05). 不经常食用新鲜蔬菜者p53基因第5外显子突变率为37.5%, 显著高于经常食用新鲜蔬菜者的8.8%(P <0.05, OR=6.20, (0.97-39.7). 林州吸烟、饮酒、不食用新鲜蔬菜、食管癌家族史等因素与林州食管癌p53基因第5外显子突变未见显著性联系, 食用酸菜者p53基因第5外显子突变率为38.5%, 显著高于不食用酸菜者的17.1%(P <0.05, OR=5.63(1.10-28.84), 表2).

表2 西安和林州p53基因第5外显子突变与食管癌主要危险因素的关系.

因素		西安市					林州市
		突变	未突变	χ2	P	OR(95%CI)	突变	未突变	χ2	P	OR(95%CI)
吸烟	+	3	25			0.44	6	20			2.25
	-	3	11	0.87	0.35	(0.08-2.53)	2	15	0.87	0.35	(0.40-12.75)
饮酒	+	2	25			0.22	1	5			0.86
	-	4	11	2.92	0.09	(0.08-2.53)	7	30	0.02	0.89	(0.09-8.54)
酸菜	食用	2	10			1.30	5	8			5.63
	不食用	4	26	0.08	0.78	(0.21-8.25)	3	27	4.85	0.03	(1.10-28.84)
新鲜蔬菜	不食用	3	5			6.20	2	6			1.61
	食用	3	31	4.35	0.04	(0.97-39.7)	6	29	0.27	0.61	(0.26-10.00)
食管癌家族史	+	1	15			0.28	4	18			0.94
	-	5	21	1.36	0.24	(0.03-2.67)	4	17	0.01	0.94	(0.20-4.39)

3 讨论

本研究所有对象均为病理学确诊的食管癌患者, 两地病例均为当地常住居民, 年龄、性别无显著性差异, 具有可比性. 标本取自手术切除的癌组织, 所有调查信息通过直接询问患者本人而获得, 减少了选择偏倚和信息偏倚. DNA序列测定是目前检测基因结构、序列变异最直接、最可靠的方法. 在实验中采取了质量控制措施, 因此本文结果较为可信和真实.

p53基因是迄今发现与人类相关性最高的基因, 大约50%的人类肿瘤中发现p53基因突变. 吸烟肺癌p53突变较多发生于157、248和273密码子, 主要为G→T颠换, 认为与烟草中的致癌物苯丙荜有关, 而非吸烟患者为G:C→A:T转换[9]. 既吸烟又饮酒发生肺癌p53突变的OR值为18.6, 且有剂量-效应关系[10].口腔部肿瘤p53基因突变认为与咀嚼槟榔和烟草有联系, 有人认为p53第5外显子是经常咀嚼萎叶引起口腔癌的靶基因[11]. 因此, 对p53基因突变谱的分析有助于识别不同肿瘤的致癌因子.p53基因突变在食管癌中也较常见, 但多数研究集中于突变率与癌病理组织学分型关系、预后等方面[12-13]. 现有的文献报道多无详细的环境暴露资料, 故难以与环境致病因子进行综合分析. 本研究结果显示, 西安和林州食管癌p53基因第5外显子突变与性别、年龄均无关. 西安吸烟、饮酒、食用酸菜和食管癌家族史等食管癌主要危险因素与p53基因第5外显子突变未见显著性联系. 不经常食用新鲜蔬菜p53基因第5外显子突变率为37.5%, 显著高于经常食用新鲜蔬菜者的8.8%(P <0.05), OR=6.20(0.97-39.7). 新鲜蔬菜含有VitA, VitC 等大量维生素. 研究表明, 新鲜蔬菜、水果和维生素等有抗突变的作用, 维生素C在体内外能阻断胺类的亚硝基化[14]. 本研究表明, 在西安地区, 经常食用新鲜蔬菜可对抗p53基因突变而减少食管癌的发生.

林州单因素分析未发现吸烟、饮酒、食管癌家族史和食用新鲜蔬菜与p53基因第5外显子有显著性联系, 但与食用酸菜有明显联系, 其OR值为5.63(1.10-28.84), 食用酸菜者p53基因第5外显子的突变率38.5%显著高于不食用酸菜者的17.1%(P<0.05). 酸菜中含有包括亚硝酸胺在内的多种致癌亚硝基化合物. 有人用甲基苄基亚硝胺(NMBzA)诱发的人胎儿食管癌组织发现有抑癌基因Rb, p53, APC和MCC的突变[15]. 林州居民有食用酸菜的习惯, 酸菜中致癌物的量积累到一定程度, 可能诱发包括p53基因在内的癌基因发生突变而诱导食管癌的形成.

备注

$[Footnotes]

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