乙型肝炎患者外周血单个核细胞分泌IFN-γ的实验研究

摘要

目的: 探讨外周血单个核细胞(PBMC)分泌g干扰素(IFN-γ)水平在慢性乙型肝炎发生、发展中的意义.

方法: 采用ELISA法测定20名正常人和44例HBV感染者的PBMC经植物血凝素(PHA)刺激前后IFN-γ在上清液中的表达水平.

结果: 正常及患者组PBMC上清液中IFN-γ有低水平的活性表达; 经PHA刺激后其活性明显升高(对照组23.7±12.7升高至117.2±64.7 pg/mL, n=20, t = 10.41, P <0.01; 轻度组24.6±9.3升高至57.4±27.1 pg/mL, n=21, t=4.92, P <0.01; 中度组30.1±15.5升高至81.6±42.2 pg/mL, n=15, t=4.45, P <0.01; 重度组35.6±17.9升高至114.5±49.3 pg/mL, n = 8, t = 4.26, P <0.01), 但患者组IFN-γ水平显著低于正常对照组(177.2±64.7 vs 57.4±29.1、81.6±42.2、114.5±49.3 pg/mL, t值分别为7.50、5.28和2.77, P <0.01); 患者组IFN-γ与血清HBV-DNA水平呈明显负相关(g=-0.49, P <0.01).

结论: 乙型肝炎慢性化以及高复制状态可能与PBMC分泌IFN-γ活性降低有关.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: May 27, 2004
Revised: June 9, 2004
Accepted: July 22, 2004
Published online: October 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

原始辅助性T细胞(Tho)根据其分泌细胞因子的功能不同, 可分为I型辅助性T细胞(Th1)和II型辅助T细胞(Th2). Th1分泌g-干扰素(IFN-γ)为主并介导细胞免疫, 而Th2以分泌白介素4(IL-4)等细胞因子并介导体液免疫. IL-18能够刺激Th1细胞产生IFN-γ[1], 促进Th1增生及Fas介导的NK细胞的细胞毒作用[2].检测IFN-γ活性水平, 可以反映Th1细胞和细胞因子IL-18的功能以及抗病毒作用[3].为研究IFN-γ在慢性乙型肝炎发生、发展中的意义, 我们检测外周血单个核细胞(PBMC)分泌IFN-γ的水平及其诱生活性.

1 材料和方法

1.1 材料

正常对照组20例, 年龄20-51岁, HBV-M阴性.慢性乙型肝炎患者44例(诊断符合1995年第五次全国传染病寄生虫病学术会议制定的诊断标准), 年龄20-55岁, 其中轻度组21例, 中度组15例, 重度组8例. HBsAg、HBeAg和抗-HBc阳性, HbsAg、抗-HBe和抗-HBc阳性, HBsAg和抗-HBc阳性.ALT为40-800 U/L. 实验仪器有西安二六二厂的FJ-2021型g-计数器, 上海精密仪器公司的722s型分光光度器, 北京普朗公司的DNM-9602型酶标仪, 珠海黑马公司的Hema 800型扩增仪, 法国ABX Micros型全自动血球分析仪等.

1.2 方法

无菌采取静脉血10 mL, 其中4 mL分离血清, 6 mL肝素抗凝.抗凝血用淋巴细胞分离液(上海试剂二厂产品)常规分离PBMC, PBMC用pH7.4 PBS洗涤细胞2次, 细胞计数后用于实验. 加入2 mL RPMI 1640培养液, 加入约2 mL PBS调整细胞密度为10⁹/l. 一组为PBMC悬液; 另一组为PBCM+植物血凝素(PHA, 上海伊华医学科技公司产品), PHA终浓度30 ug/mL.两组置于37℃, 50 ml/L CO₂恒温箱培养48 h, 离心后取上清液置于-20 ℃备用. 用双抗体夹心ELISA法测定IFN-γ(试剂为上海森雄公司进品分装产品), 严格按说明书操作.血清用PCR-ELISA技术定量检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA), 试剂为广州蓝星公司产品.数据以mean±SD表示, 采用配对t检验.

2 结果

正常及患者组PBMC上清液中IFN-γ有低水平的活性表达, 经PHA刺激后其活性明显升高(P <0.01); 正常及患者组PBMC经PHA刺激后, 患者组IFN-γ水平显著低于正常对照组(P <0.01, 表1).慢性乙型肝炎患者组PBMC经PHA刺激后, IFN-γ表达水平与血清HBV-DNA水平呈明显负相关(g=-0.49, P<0.01).

表1 慢性乙型肝炎患者PBMC分泌和IFN-γ活性.

分组	n	PBMC	PBMC+PHA
对照组	20	23.7±12.7	177.2±64.7b
轻度组	21	24.6±9.3	57.4±29.1bd
中度组	15	30.1±15.5	81.6±42.2bd
重度组	8	35.6±17.9	114.5±49.3bd

^bP <0.01 vs PBMC组比较;

^dP <0.01 vs 对组照比较.

3 讨论

ELISA法检测IFN-γ简单、实用、快捷、灵敏.PHA激活PBMC成功获得IFN-γ的活性表达.实验的关键是分离PBMC和选择刺激物的浓度.用淋巴细胞分离液所获的PBMC, 但以淋巴细胞为主, 有T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、K细胞和NK细胞等.

免疫功能紊乱是慢性乙型肝炎的主要发病机制, 其主要表现有CD4细胞减少, CD8细胞增高, CD4/CD8比值降低; Th1和Th2免疫应答失衡; 淋巴细胞凋亡增加等. 由于免疫功能受损, 使乙型肝炎患者不能清除HBV易成为慢性感染. Th1细胞分泌的IFN-γ能在转录后水平抑制肝炎病毒, 又能通过免疫调节来增强机体防御能力[4]. Xing et al[5]应用ELISA和RT-PCR方法研究Th1和Th2表达与IFN-γ治疗作用之间关系时, 发现乙肝患者PBMC上清液中的IFN-γ水平比正常人稍低, 而在应用IFN-γ治疗后, IFN-γ水平稍升高, 与治疗前相比, IFN-γ水平在治疗24 wk后明显升高.因此, Th2细胞因子表达在慢性乙肝患者中占优势, IFN-γ能够调节Th1和Th2之间的平衡, 因而与临床效应有关, 而Th1和Th2水平可能是预测干扰素治疗期间临床反应的重要因素. Th1细胞分泌IFN-γ的功能, 是通过IL-18, IL-12等的调节, 促进Th1细胞应答, 维持Th1, Th2细胞平衡, 促进IFN-γ的表达与合成.否则导致Th2细胞占优势而抑制细胞免疫, 并导致HBV的持续感染[6]. Jiang et al[7]也发现Th1细胞不仅随着肝炎活动性增强而显著升高, 而且在慢性乙肝活动期也明显升高. 因此, Th1细胞就与慢性乙肝的肝炎活动性呈正相关, 而Th2细胞则与乙肝病毒感染慢性化有关.

HBV感染的清除需要活性T辅助细胞和T淋巴细胞反应的参与. Manigold et al[8]应用ELISA和RT-PCR方法测定急性和慢性乙型肝炎及健康人PBMC中HbcAg介导的IL-18产物的调节时, 发现血清IFN-γ水平与慢性乙型肝炎患者病毒血症呈反相关.

树突细胞是最有效的抗原传递细胞, 而在诱发抗病毒免疫反应中起重要作用. Beckebaum et al[9]应用体外繁殖和用HBV颗粒接种方法, 探讨MO-DC功能障碍机制时, 发现HBV感染会遭致T辅助细胞I型反应减少, 同时, 由T细胞产生的IFN-γ水平亦明显降低, 因此引起乙肝病毒逃避免疫治疗, 从而导致乙型肝炎出现慢性化. 自体树突细胞刺激能力不足可能是T细胞能力降低的原因, 也因此导致乙型肝炎病感染患者慢性化. Lohr et al[10]的研究也发现, T细胞刺激能力不足会导致慢性乙型肝炎患者抗病毒免疫能力减弱, 而IL-12免疫刺激可保存HBV抗原物异性T细胞反应, 在对克服HBV慢性化的治疗上有益.

Hodgson et al[11]研究发现急性病毒性肝炎恢复后的患者, 其IFN-γ水平可能会升高, 而且, 肝脏中这样的IFN-γ水平升高可能会持续多年, 因此, 他们认为抗病毒因子, 特别是IFN-γ可能在肝脏中的潜伏性肝DNA病毒的长期控制治疗上起着重要作用.

HBV慢性化会导致潜在的破坏性极大的严重后果, 而且, 这种慢性化乙肝治疗起来难度极大. 但应用干扰素, 特别是IFN-γ治疗可能会有所效果. 但是, 为了保持肝脏中干扰素水平达到治疗效果, 又常会引起严重的不良反应, 而应用基因治疗则可能会解决此问题.Matskevich et al[12] 通过基因转染方法, 将HBV全部基因组转染至肝细胞模拟成HBV感染时, 发现IFN表达被激活, 同时分泌和产生IFNs, 从而保护肝细胞免受HBV的感染. 而且, 他还能保护周围未受转染的肝细胞免受HBV的感染. 因此, 应用基因载体表达的IFN治疗慢性乙型肝炎, 可能是预防乙型肝炎慢性化的一个非常有吸引力的治疗选择.

由于IL-12可通过T细胞和NK细胞诱发产生并激活IFN-γ在抗肿瘤免疫反应中起重要作用, 因此, Imanishi et al[13]在研究肝细胞癌、肝硬化、慢性肝炎及健康人PBMC中由IL-12诱发产生的IFN-γ水平活性时, 发现肝细胞癌患者IFN-γ水平活性明显低于肝癌的癌前病变-肝硬化患者以及慢性肝炎患者的IFN-γ水平. 因此, 他们认为测定IFN-γ水平有利于从免疫学角度上评价慢性肝脏疾病的严重性. Watson et al[14]也发现丙型肝炎患者PBMC中IFN-γ水平活性是其疾病严重性的一个有效判别因子. 因此, 研究HBV感染者IFN-γ的诱生活性, 有助于了解机体的免疫状态, 对治疗有一定的指导意义.我们所用的PHA终浓度能激活PBMC分泌IFN-γ到一个较高水平. 而且, 我们观察到正常人和慢性乙型肝炎患者PBMC均有低水平的IFN-γ活性表达, 被PHA激活后IFN-γ的表达水平显著升高, 但慢性乙型肝炎患者的IFN-γ水平显著低于对照组. 轻度患者的IFN-γ表达水平最低, 这类患者临床症状较轻, 肝功能损害不明显, 对HBV感染呈现免疫耐受, 可能与HBV的持续感染有关. 重度患者的IFN-γ表达水平最高, 这类患者临床症状较重, 肝功能损害明显, 对HBV感染有强烈的免疫反应, 可能与HBV的免疫清除有关[3,15].

总之, IFN-γ的活性水平降低可能是乙型肝炎慢性化的机制之一, 了解IFN-γ在慢性乙型肝炎病毒感染者不同阶段的水平变化有助于了解和观察病情演变及预后, 评价慢性肝脏疾病的严重性, 并为进一步探讨IFN-γ的抗病毒作用及研究开发慢性乙型肝炎的基因治疗等新的途径和方法提供重要的理论依据.

备注

$[Footnotes]

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