丙型肝炎的实验室诊断和临床意义

摘要

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Correspondence to: N/A

Received: September 20, 2004
Revised: September 29, 2004
Accepted: October 8, 2004
Published online: October 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染的实验室诊断是丙型肝炎诊断的重要依据, 主要包括特异性抗体(抗-HCV)的检查、HCV基因和HCV核心抗原的检测以及肝细胞损害的检查. 抗-HCV阳性是感染的标记, 感染的间接证据; 而病毒基因和抗原检测阳性是病毒存在的直接证据. 肝细胞损害的检查往往以肝脏酶学检查, 特别是丙氨酸氨基转移酶(ALT)来反映, ALT、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平变化可反映肝细胞损害程度, 但ALT、AST水平与HCV感染引起的肝组织炎症分度和病情的严重程度不一定平行, 慢性丙型肝炎患者中, 约有30% ALT水平正常, 约40%ALT水平低于2倍正常值上限. 非侵袭性的肝纤维化评价非常困难, 也没有可靠的指标来预测肝纤维化的进展速度, 仅肝组织学检查是金标准. 高水平的ALT往往伴有高危险的肝纤维化. 常规实验室检查中血小板计数降低、AST/ALT比值增高和凝血酶原时间延长是肝硬化和门静脉高压最早的标志. 此外, 有一些生物化学检查来间接反映肝脏的纤维化情况, 其可靠性需要进一步评价. HCV感染者一旦发生肝硬化, 肝癌的年发生率为1-4%, 对于这部分患者还应该监测AFP. 本文则主要介绍病毒学标志的检测和意义[1-3].

1 病毒学检测的技术

病毒学检测的技术: 包括酶免疫技术和分子生物学技术. 酶免疫技术广泛用于血清中的病毒抗原和抗体的检测, 包括检测HCV核心抗原与抗-HCV的酶免疫测定(EIA)或酶联免疫黏附实验(ELISA), 以及检测特异性抗体的免疫印迹测定.酶免疫技术还可用于HCV的血清学分型. 分子生物学技术既有定性和定量测定病毒基因的靶扩增或信号扩增技术, 也有用于病毒基因分型的序列分析和反向杂交.

检测HCV基因最常用的靶扩增技术是聚合酶链反应(PCR). 因为HCV是RNA病毒, 须先经过逆转录(RT)合成互补的双链DNA, 然后在DNA聚合酶作用下, 使病毒某基因片段呈指数扩增, 获得大量的双链DNA; 另一个靶扩增技术为转录介导的扩增(TMA), 依赖逆转录酶合成互补DNA链, 再以RNA聚合酶合成扩增产物单链RNA. 以上两种方法都在获得有效扩增后, 通过特异性探针与扩增产物的杂交而显示. 如在扩增体系中加入标准对照, 即可通过竞争结合的原理, 根据标准对照扩增获得的标准曲线对病毒模板的相对数量进行定量.近来发展起来的实时PCR可以在PCR扩增过程中对扩增模板, 可避免因过度扩增而造成的污染, 比传统的靶扩增更敏感, 且所测定的动态范围更宽. 信号扩增是对以特异性探针捕获HCV模板后对杂交探针的信号加以扩增, 病毒本身的模板不扩增, 依靠同时检测的标准品制备标准曲线进行定量. 反向杂交主要用于HCV基因分型, 其他基因分型的分子生物学技术因为难以标准化已较少使用. HCV RNA的定量和定向检测敏感性和精确性还需要进一步改善和提高, 从而提高对应答的确定, 同时还加深对抗病毒治疗拮抗的认识. 在技术上还需要进一步标准化和自动化.

2 HCV感染标志的检测和意义

与HCV感染临床处理有关的病毒感染标志主要有HCV RNA、抗-HCV、HCV核心抗原和HCV基因型四种.

2.1 HCV RNA

是HCV活跃复制的可靠标志, 表示肝内有HCV存在和复制.常常在感染后1-2 wk即可在外周血中测得, 在自然清除病毒的感染者中, 常在清除前达高峰; 而在慢性感染者, 常常在高峰后逐渐下降渐至较低水平而维持在稳态, 每天产生10¹²个病毒颗粒, 半衰期3 h. 有时在持续感染中可能有短暂的低水平复制, 低于检测水平. HCV RNA复制水平与疾病严重性无关, 仅仅在终末期肝病因为有功能肝细胞的减少和纤维化而使病毒处于低水平或低于检测水平. 在肝移植后, HCV可再次升高.

HCV RNA的检测既可以定性也可以定量, 测定的意义在于确定感染、指导治疗和判断应答. 目前, 定性检测的敏感性高于定量检测试剂. PCR与TMA定性检测试剂的敏感性分别达到50国际单位(IU)/mL和10 IU/mL, 特异性均可达到98-99%. 定量检测方法除了PCR和TMA外, 还有信号扩增的分支链DNA. 以往不同定量检测方法的单位不一致, 同一份临床样本不同检测方法所得结果不同. 为此, 世界卫生组织(WHO)近年建立了国际标准以IU来反映HCV RNA的量, 从而便于HCV RNA定量检测的全球标准化[4]. 国际单位并不能真正反映样本中的病毒颗粒, 只是反映HCV RNA的量. 现行的HCV RNA测定都采用国际单位来表示检测值(表1), 使现在的临床指南和各种诊断治疗推荐意见可比性强.对于以往非标准化检测的结果也可以通过系数进行转换(表2). 定量检测的敏感性低于定性检测, 最低检测阈值为25-615 IU/mL. 线性检测范围的上限500 000- 7 700 000 IU/mL. 对于超过检测线形范围上限的样本应该稀释10-100倍后再检测, 方能获得准确定量. 定量检测的特异性为98-99%, 不受基因型的影响.

表1 血清HCV RNA定量测定的方法与动态范围[1].

测定方法	测定技术	动态范围
Amlicor HCV monitor 2.0	手工操作, 竞争RT-PCR	600-< 500 000 IU/mL
Cobas Amlicor HCV monitor 2.0	半自动, 竞争RT-PCR	600-< 500 000 IU/mL
Versant HCV RNA 2.0	手工, 分支链DNA	200 000-120 000 000
基因/mL Versant HCV RNA 3.0	半自动, 分支链DNA	615-7 700 000 IU/mL
LCx HCV RNA	半自动, 竞争RT-PCR	25-2 630 000 IU/mL
Superquant	半自动, 竞争RT-PCR	30-1 470 000 IU/mL

表2 各种HCV RNA定量测定的基因拷贝与国际单位换算[1].

测定方法	换算方法
Amlicor HCV monitor 2.0(手工操作)	1 IU/mL=0.9 拷贝/mL
Cobas Amlicor HCV monitor 2.0(半自动)	1 IU/mL=2.7 拷贝/mL
Versant HCV RNA 3.0	1 IU/mL=5.2 拷贝/mL
LCx HCV RNA	1 IU/mL=3.8 拷贝/mL
Superquant	1 IU/mL=3.4 拷贝/mL

2.2 抗-HCV

现在临床上常常使用第二代或第三代抗-HCV试剂, 表3概括了国际上现行的第二代与第三代抗-HCV诊断试剂及其所包被的HCV抗原. 现行抗-HCV诊断试剂的特异性超过99%, 但由于缺少金标准而难以明确其敏感性. 免疫功能正常的HCV感染者中99%以上抗-HCV阳性.HCV感染后产生抗-HCV的窗口期依不同患者而有所不同, 第三代诊断试剂的窗口期一般为7-8 wk, 50-70%的感染者再出现症状时抗-HCV阳性; 在感染自发清除的患者中, 抗-HCV往往持续终生, 少数可能处于低水平并可能在几年后逐渐消失[5]. 除了血液透析和免疫抑制患者以外, 慢性感染者抗-HCV始终为阳性.

表3 抗-HCV检测的酶免疫方法[1].

检测试剂	检测技术	包被的HCV抗原
Ortho HCV 3.0(第三代)	EIA	核心, 非结构基因(NS)3, NS4, NS5
Vitros(第三代)	EIA	核心, 非结构基因(NS)3, NS4, NS5
Abbott HCV EIA 2.0(第二代)	ELISA	核心, 非结构基因(NS)3, NS4

按照美国疾病控制中心2003年新的HCV抗体报告和实验室检测导则[6], 抗-HCV仅仅在重复检测滴度≥3.8时才可能是真正的抗-HCV阳性, 而对于抗体滴度低于3.8者应该以免疫印迹试验来确认EIA检测的抗-HCV. 近来, 由于抗-HCV诊断试剂质量的改善, 免疫印迹试验在临床已很少应用, 但在血库低危人群中的筛查中, 由于抗-HCV的阳性预测值远低于临床应用, 所以免疫印迹往往只应用于血库低危人群的筛查. 在美国和欧盟, 曾有以病毒核酸检测替代免疫印迹试验的趋势, 但其成本-效益问题还有争论. 所以, 2003年的美国CDC导则又重新提出免疫印迹检测的应用.国内有关单位在国际科技攻关资金资助下进行了不同区抗原的EIA试剂研制, 发现不同区抗原片段抗体的检出率差异较大, 以NS3和核心区抗体检出率最高[7]. 该检测试剂在一定程度上可以完成免疫印迹类似的工作.对于低危人群, 则不需要常规进行抗-HCV的筛查[8].

2.3 HCV核心抗原

20面体的HCV核衣壳由多聚HCV核心蛋白组成. HCV核心抗原在外周血中有游离抗原与总抗原两种状态, 前者存在于抗-HCV阳转前, 晚于HCV阳性1-2 d. 在抗-HCV出现后, 所测定的HCV抗原为总抗原, 与HCV RNA的水平相平行, 其含量可以作为HCV复制的标志, 以pg/mL表示, 从而可以作为病毒复制的替代检测标志, 1 pg HCV总抗原相当于8 000 IU的HCV RNA. 在不同患者间检测结果略有差异.当HCV RNA低于20 000 IU/mL时, 现行HCV总抗原检测试剂不能检测到HCV抗原, 限制了其临床应用. 此外, HCV核心抗原检测对于早期病毒血症的检测是敏感的, 但不适宜用于病毒清除的实时监测[9].

2.4 HCV基因分型

HCV为单股正链RNA病毒, 其基因组易于变异.目前已发现6个基因型和数十个基因亚型. 以1a、2b、3c等表示. 分子进化分析可以鉴别不同的基因型和基因亚型. 基因型、基因亚型和株间的序列异源性分别为30%、20%和10%.

HCV基因分型的金标准是包膜区(E1)或非结构基因(NS)5B的序列分析并与参考序列的比较以及分子进化分析. 临床的基因分型可以通过直接序列分析, 型特异性寡核苷酸探针的反向杂交或限制性酶切长度多态性分析来确定. 基于5'端非编码区(5'NTR)直接序列分析的基因分型和型特异性寡核苷酸探针的反向杂交均已标准化, 两种方法均能测定HCV的6个基因型和一系列基因亚型. 对基因型的检测误差不多, 但基因亚型的分型错误约为10-25%. 这些错误并非由技术造成的, 而是与所选择的测定基因区(5'NTR)有关. 由于只有基因型与临床的关系密切, 基因亚型的分型检测错误对临床影响不大.

检测不同基因型的特异性抗体也可以进行基因分型, 但不能区别不同的基因亚型. 90%免疫功能相对正常的慢性感染者可以通过血清学方法鉴别基因型, 与分子生物学方法的符合率达95%, 对基因1型的检测效果优于其他基因型. 对于血清学方法与分子生物学方法检测结果不一致的感染者, 以E1或NS5B区基因的序列分析往往与分子生物学分型结果一致. 血清学分型的另一个不足是检测结果有时表现为混合反应, 此时, 不能区别是真正的混合感染抑或为交叉反应, 也可能为一个基因型感染的恢复而另一个基因型感染持续存在的结果.

3 不同感染过程与状态下各标志的变化和作用

3.1 HCV感染的诊断

急性丙型肝炎、不明原因的急性肝炎都应该检测HCV RNA和抗-HCV. HCV RNA阳性而抗-HCV阴性强烈提示急性丙型肝炎, 并且抗-HCV将在进一步随访中出现阳性. 如果HCV RNA和抗-HCV均阳性, 或仅仅抗-HCV阳性, 则不会是急性丙型肝炎. 但是, 由于HCV可能出现间隙性病毒血症, 对抗-HCV阳性而HCV RNA阴性者应该在几周后再次检测HCV RNA.应当指出HCV RNA和抗-HCV均阳性时, 很难鉴别是急性丙型肝炎或慢性丙型肝炎, 也可能是慢性丙型肝炎合并其他肝炎.

慢性肝脏疾病患者HCV RNA和抗-HCV阳性, 诊断为慢性丙型肝炎. HCV RNA阳性而抗-HCV阴性很少发生于免疫功能相对正常的患者中, 仅仅出现于血液透析和免疫抑制的患者中. 献血员筛选和在高危人群检查中抗-HCV阳性可以通过检测HCV RNA而确定.如果间隔6 mo以上2次检测HCV RNA均为阴性, 则很难区别是既往HCV感染后的抗-HCV抑或假阳性. EIA测定中S/Co比值超过3.8往往为真阳性或者通过免疫印迹方法加以确认, 而EIA测定中S/Co比值低于3.8, 往往难以确定, 因为部分HCV感染自发清除后抗HCV逐渐降低.

因为抗-HCV可以通过胎盘, 且在婴儿出生后不论是否有病毒的母婴传播, 抗-HCV将持续数月甚至超过1年, 所以, 母婴传播的确定只能依靠HCV RNA的测定. HCV的母婴传播一旦发生, 在分娩后几天或稍晚即可在新生儿血清中测到HCV RNA, 此后可能持续存在也可能自发清除. 母婴传播后的HCV自发清除率和清除时间都不太清楚, 可以肯定的是HCV母婴传播的自发清除率高于成年感染的自发清除率. 出生后HCV RNA检测的时间不是很明确, 一般推荐时间是6-12 mo. 如果出生1年后抗-HCV仍持续高滴度, 应考虑感染的慢性化并检测HCV RNA.

职业性非胃肠途径暴露1-2 wk后即可检测到HCV RNA, 在暴露后1 wk即可以进行监测. HCV RNA阳性是急性感染的标志, 但并不一定立即给予治疗, 仅在ALT升高和出现症状时开始治疗.

3.2 疾病进展的预测

HCV病毒标志没有预测价值, HCV RNA复制水平和HCV基因型均与肝脏损害的严重程度及纤维化无关. 也不能预测感染的自然史和疾病预后. 因此, 临床上患者常规处理和监测并不需要反复检测HCV RNA.

3.3 抗病毒治疗

仅HCV RNA阳性的患者才考虑抗病毒治疗. 治疗前应该检测HCV的基因型, 目前慢性丙型肝炎抗病毒治疗最有效的方法是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林, 基因型的测定有助于决定疗程和利巴韦林的剂量. 基因2和3型感染仅需要治疗24 wk, 利巴韦林用量为800 mg/d即可达到70-80%的持续病毒学应答. 而基因1型感染需要48 wk疗程, 利巴韦林用量应达到1 000-1 200 mg/d. 尽管如此, 其持续病毒学应答仅达到40-45%[10-13]. 国外认为, 对于这部分感染者应该权衡抗病毒治疗的益处, 不治疗的危险性以及经济价值, 对于肝组织学检查有显著坏死炎症和纤维化者应予以治疗, 而仅有轻度炎症者则不需要治疗. 国内对国人的临床研究发现, 单剂聚乙二醇干扰素a2a对基因1型感染的慢性丙型肝炎的治疗结束时应答和持续应答分别为76.8%和35.4%, 非基因1型感染的慢性丙型肝炎的治疗结束时应答和持续应答分别为81.0%和66.7%[14].

基线HCV RNA测定对基因2、3型感染者意义不大, 治疗结束时HCV RNA阴性提示获得病毒学应答, 应在24 wk再次检测以评价其持续应答; 而治疗结束时HCV RNA仍然阳性则可能出现复发. 基因1型感染者接受聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗时, 在治疗前和12 wk时测定HCV RNA可以评价早期病毒学应答, 12 wk时HCV RNA下降2个对数单位或阴性者应继续治疗至48 wk, 如果未获得早期病毒学应答, 即使治疗48 wk, 获得持续病毒学应答的几率也很低, 此时可以停药或者仅仅为了达到延缓疾病的进展而治疗, 但不能清除病毒. 在48 wk疗程后再次测定HCV RNA阳性强烈提示复发. 对48 wk疗程结束后HCV RNA阴性者应在24 wk后再次测定, 可以评价持续病毒学应答.

已有证据表明, 对急性丙型肝炎患者予以单剂常规干扰素治疗是有效的, 但是, 病毒学检测对于决定是否干扰素治疗、治疗的剂型、剂量和疗程都没有特殊价值. 治疗结束后应测定HCV RNA, 阴性者在24 wk还需再测定一次.

在抗病毒治疗开始后1 wk和4 wk, HCV核心抗原与HCV RNA即降低[15]; 在治疗过程中对这两个指标的监测均能反映抗病毒治疗的效果, 但HCV总抗原的检测不能确切反映病毒清除的时间[9].

4 未治疗患者的随访

由于HCV病毒学检测对于预后没有预测价值, 所以, 未治疗的患者不一定需要反复的病毒学检测, 但对ALT和肝组织学进行随访是有意义的.

备注

$[Footnotes]

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