修回日期: 2004-09-13
接受日期: 2004-09-19
在线出版日期: 2004-10-15
目的: 探讨乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC7901凋亡的相关基因Fas和FasL影响.
方法: 胃癌细胞株SGC7901细胞由山东医科院提供. 采用脂质体介导乙酰肝素酶反义寡核苷酸转染人胃癌细胞株SGC7901细胞, 以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后乙酰肝素酶mRNA、Fas mRNA和FasL mRNA表达的变化, 采用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化.
结果: 脂质体介导转染乙酰肝素酶反义寡核苷酸后, SGC7901胃癌细胞内乙酰肝素酶mRNA和FasL mRNA表达下降(分别为1.13±0.05 vs 0.36±0.22, t = 8.37, P = 0.0 001<0 01; 1.11±0.24 vs 0.35±0.23, t = 5.48, P = 0.0 003<0.01), Fas mRNA表达上升(0.45±0.23 vs 1.02±0.02, t = 6.05, P = 0.0 001<0 01), 转染前后各组细胞凋亡率分别为4.04%, 3.85%, 3.38%, 9.13%, 16.00%, 15.63%及13.32%.
结论: 转染乙酰肝素酶反义寡核苷酸可以有效诱导胃癌细胞发生凋亡
引文著录: 周世庆, 真岩波, 汪素文, 张淑红, 王德荣. 乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃腺癌SGC7901细胞Fas和FasL表达的影响. 世界华人消化杂志 2004; 12(10): 2287-2290
Revised: September 13, 2004
Accepted: September 19, 2004
Published online: October 15, 2004
AIM: To evaluate the effect of heparanase antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN) on the expression of Fas and FasL in human gastric adenocarcinoma cell line SGC7901.
METHODS: Human gastric adenocarcinoma cell line SGC7901 was transfected with liposome-mediated heparanase AS-ODN. The expression of heparanase mRNA, Fas mRNA and FasL mRNA was detected after transfection using semi-quantitative RT-PCR. The apoptotic rates of transfected SGC7901 cells were detected by flow cytometry.
RESULTS: The expression of heparanase and FasL gene in SGC7901 cells transfected with AS-ODN significantly decreased as compared with those in the controls (1.13±0.05 vs 0.36±0.22, t = 8.37, P = 0.0 001<0.01; 1.11±0.24 vs 0.35±0.23, t = 5.48, P = 0.0 003<0.01 respectively), but Fas gene expression was significantly increased as compared with that in the controls (0.45±0.23 vs 1.02±0.02, t = 6.05, P = 0.0 001<0.01). The apoptotic rates were 9.13%, 16.00%, 15.63% and 13.32% in SGC7901 cells transfected with AS-ODN at the concentrations of 0.1, 0.2, 0.4 and 0.8 mmol/L, respectively.
CONCLUSION: Apoptosis of human gastric carcinoma cell line SGC7901 can be effectively induced after transfected with heparanase AS-ODN.
- Citation: Zhou SQ, Zhen YB, Wang SW, Zhang SH, Wang DR. Effect of heparanase antisense oligodeoxynucleotide on expressions of Fas and FasL in human gastricadenocarcinoma cell line SGC7901. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004; 12(10): 2287-2290
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v12/i10/2287.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v12.i10.2287
乙酰肝素酶是一种糖苷内切酶, 与肿瘤的侵袭和转移密切相关, 在肿瘤的发生发展过程中具有重要的作用.近年来发现, 其与肿瘤细胞的凋亡有关. 反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, AS-ODN)作为一种新型的药物, 通过多种途径介导靶细胞mRNA的降解、抑制DNA的复制、转录和转录后的加工和翻译. 为此, 我们设计了一种针对乙酰肝素酶mRNA翻译起始位点的AS-ODN,采用脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901, 以封闭乙酰肝素酶基因的表达, 并观察其对胃癌细胞凋亡相关基因Fas、FasL的作用.
人胃癌细胞株SGC7901为山东省医科院提供, 水浴复苏后接种于30 mL培养瓶及铺有无菌盖玻片的6孔培养板, 以含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养液常规培养至80%汇片后进行转染. 硫代磷酸型寡核苷酸由上海生工生物工程公司合成, 序列如下: AS-ODN序列: 5'GCTTCGAGCGCAGCAGCAT 3'; 无意义核苷酸(nonsense oligodeoxynucleotide, NS-ODN)序列: 5'TCAGCTAGCGAGGCTGCGCA 3'. 两条序列均采用硫代磷酸型, 即在合成时用巯基取代寡核苷酸片段磷上的羟基. 按照DOTAP脂质体转染试剂盒(Roche, USA)说明配制不同浓度的DOTAP-ODN复合物进行转染. 实验分对照组(不进行转染), 脂质体对照组(转染时只加脂质体), NS-ODN组(以脂质体转染NS-ODN)和AS-ODN组(以脂质体转染AS-ODN). 根据预实验结果, NS-ODN各浓度组对实验结果均无影响, 在以10 ml/ml Lipofectin转染的情况下, AS-ODN在0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L和0.8 mmol/L终浓度时转染率较高, 故选择此浓度梯度进行实验.
寡核苷酸的转染. 采用阳离子脂质体Lipofectin (美国GIBCO公司)转染. 将SGC7901细胞接种于6孔板, 培养至约80%覆盖率. 去除培养基, 以温热的无血清RPMI 1640漂洗细胞2次. 将寡核苷酸溶于无血清RPMI 1640 100 mL, 另取Lipofectin 10 mL溶于预暖的无血清RPMI 1640 90 mL, 室温下静置30 min后将二者轻柔混合, 室温下孵育15 min, 以无血清RPMI 1640 800 mL稀释后轻铺于细胞上, 不加抗生素, 37 ℃, 5% CO2孵箱孵育. 8 h后去除转染液, 换以含100 mL/L 小牛血清的RPMI 1640继续培养. RT-PCR检测乙酰肝素酶mRNA, Fas mRNA和 FasL mRNA的表达. 每只收集细胞沉淀的Eppendorf管中加入GIT变性液500 mL, 轻轻吹打至细胞裂解. 每管加入pH4.0 2 moL/L NaOAc 50 mL, 颠倒混匀; 再加入水饱和酚500 mL, 轻轻混匀; 最后加入氯仿100mL, 颠倒充分混匀, 冰浴10-15 min. 4 ℃ 1 200 r/min离心10 min, 吸取上清移至另一新1.5 mL Eppendorf管中, 加入等体积的异丙醇, -20 ℃放置1 h. 4 ℃ 15 000 r/min离心10 min, 弃上清, 加入GIT变性液100 mL, 轻轻吹打, 使沉淀溶解, 加入等体积的异丙醇, -20 ℃放置1 h. 4 ℃ 15 000 r/min离心10 min, 弃上清, 用无水乙醇洗一遍, 弃上清, 自然晾干, 溶于适量的无Rnase的去离子水中, 直接应用, 亦可加入无水乙醇1 mL于-70 ℃保存备用. RT-PCR采用一步法试剂盒, 按厂家推荐步骤进行.实验中以β-actin为内参照, 对样品模板用量标准化.引物设计:β-actin(317 bp)上游: 5'ATCATGTTTGAGACCTTCAACA 3', 下游: 5'CATCTCTTGCTCGAAGTCCA 3'; 乙酰肝素酶(585 bp)上游: 5'TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC 3', 下游: 5'GTAGTGATGCCATG TAACTGAATG 3'; Fas(339 bp)上游: 5'CCATGGCTTGAAGTGGAAAT 3', 下游: 5'ATTTATTGCCACTGTTTCAGG 3'; FasL(499 bp)上游: 5'ATGTTTCAGCTCTTCCACCTACAGA 3'; 下游: 5'CCAGAGAGAGCTCAGATACGTTGAC 3'. RT-PCR循环条件: 94 ℃变性1 min, 58 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min共35个循环, 最后72 ℃充分延伸7 min. 基因扩增产物在15 g/L琼脂糖凝胶上电泳, 拍照. 将凝胶电泳图像输入美国Kodak凝胶分析系统, 应用1D Image Analysis Software进行表达强度分析, 按下公式计算相对系数:相对系数=细胞因子表达强度/β-actin表达强度. MTT法检测细胞的增生活性.不同AS-ODN浓度组细胞共培养0、24、48、72、96 h后, 做MTT染色. 以每毫升活细胞数为纵坐标, 培养时间为横坐标, 描绘SGC7901细胞生长曲线. TUNEL法检测细胞的凋亡率. 取对数生长期SGC7901细胞, 反复吹打后收集细胞, Hanks液洗涤一次, 用1640培养液调细胞数为2×105 mL, 加入50 mL培养瓶, 于37 ℃ 50 mL/L CO2培养箱中培养过夜, 待细胞贴壁至约70-80%时, 弃去细胞培养液, 并用无血清无双抗的1640培养液洗涤细胞一次, 将形成AS-ODN/NS-ODN-LF2000的复合物小心加入培养瓶中, 轻轻混匀, 实验组不同AS-ODN-LF2000的终浓度分别为0.1, 0.2, 0.4, 0.8 mmol/L, NS-ODN-LF2000的终浓度为0.4 mmol/L, 同时设置未处理的正常细胞对照组. 37 ℃, 50 mL/L CO2培养箱培养6 h, 弃去转染液, 加入完全1640培养液10 mL, 继续分别培养48 h分别收集细胞, 涂片, 用40 mL/L多聚甲醛固定30 min, 进行DNA末端原位标记染色检测. 凋亡指数(Apoptosis Index, AI)计算: 数5个高倍镜下>1000个细胞, 分别计数凋亡细胞和总细胞数. AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%. 收集2×106个细胞, 700 mL/L乙醇4 ℃固定, RNA酶 37 ℃孵育1 h, 1 kg/L PI 4℃染色, 流式细胞仪检测凋亡细胞的比率. multicycle软件进行数据处理. 流式细胞仪检测Fas FasL. 荧光单抗免疫标记培养48 h的SGC7901细胞, 上机前以标准荧光微球调整仪器的变异系数并稳定在2%以内, 上机后收集2万个细胞, 荧光强度以对数放大, 光散射数据存软盘, 测试完后在Macintosh650计算机上用CellQuestPlot软件(BD公司提供)分析数据, 由HP1200c/P打印结果. 以标记细胞荧光强度表示表达水平.
统计学处理 数据以均数±标准差(mean±SD)表示, 两样本间均数比较行独立样本t检验, 多个样本间比较行单因素方差分析, 由SPSS10.0软件包完成.
正常对照组、 脂质体对照组及0.4 mmoL/L NS-ODN组之间比较, 乙酰肝素酶mRNA和 FasL mRNA表达量差异无显著意义(P >0.05).与正常对照组、脂质体对照组及0.4 mmoL/L NS-ODN相应浓度组比较, AS-ODN各浓度组乙酰肝素酶mRNA和FasL mRNA表达量均显著降低(P <0.01), 而且随着AS-ODN浓度增加, 乙酰肝素酶mRNA和FasL mRNA表达量逐渐下降, AS-ODN的抑制作用具有明显的剂量依赖性.
正常对照组、 脂质体对照组及0.4 mmoL/L NS-ODN组之间比较, Fas mRNA表达量差异无显著意义(P >0.05). 与正常对照组、脂质体对照组0.4 mmoL/L NS-ODN相应浓度组比较, AS-ODN各浓度组Fas mRNA表达量均显著升高(P <0.01), 而且随着AS-ODN浓度增加, Fas mRNA表达量逐渐升高, AS-ODN的抑制作用具有明显的剂量依赖性.
AS-ODN对SGC7901细胞增生有抑制作用, 此抑制作用随着AS-ODN浓度增加和作用时间延长而增强, 呈现浓度和时间依赖关系(P <0.01).
AS-ODN能诱导SGC7901细胞的凋亡, 光镜下可见胞核内出现棕褐色染色颗粒的凋亡细胞数明显增加(表1显示).流式细胞仪定量检测凋亡细胞, G1峰左侧出现明显的凋亡峰(亚二倍体峰). 各组细胞凋亡分别为4.04%, 3.85%, 3.38%, 9.13%, 16.00%, 15.63%及13.32%, 脂质体对照组、NS-ODN组和正常对照组比较, 细胞凋亡率差异无显著意义(P >0.05), 各AS-ODN转染组细胞凋亡率均显著高于对照组(P <0.01), 但其促进作用并不具有剂量依赖性.
人类乙酰肝素酶的基因定位于染色体4q21.3位置, cDNA全长1 758 bp, 编码的活性蛋白质分子质量为50 ku[1]. 乙酰肝素酶在人类正常组织中的表达主要局限于胎盘和免疫器官, 而在多种人类恶性肿瘤如乳腺癌、食管癌、卵巢癌中有高水平表达[1-2]. 乙酰肝素酶的表达水平与肿瘤细胞的侵袭和转移潜能密切相关. 新近研究发现, 乙酰肝素酶与肿瘤细胞的凋亡有关, 但其确切机制尚不清楚. 因此, 研究凋亡相关因素可能会给研究乙酰肝素酶的调控机制以很好的启发. Fas为I型跨膜蛋白, 属肿瘤坏死因子受体(TNFR)及神经生长因子受体(NGFR)家族成员, Fas广泛存在于多种类型的细胞膜上; FasL为Ⅱ型跨膜糖蛋白, 属TNF家族成员, FasL主要表达于活性T淋巴细胞、NK细胞及LAK细胞等免疫细胞的细胞膜上, 此外在免疫豁免组织(脑、睾丸、眼)的细胞膜上也有FasL的天然表达[3]. FasL是一种细胞凋亡因子, 为Fas的配体, 当其与细胞表面的Fas结合后可激活细胞内凋亡信号, 引起Fas阳性细胞的凋亡[4].
反义寡脱氧核苷酸通过碱基互补原理, 与目的mRNA的特定序列特异性结合, 形成DNA-RNA杂合双链, 诱导内源性RNA降解酶H对mRNA链进行水解; 并通过空间位阻效应阻断mRNA的剪切加工、转运和蛋白质的翻译合成, 从而达到基因治疗的目的. 随着DNA自动化合成技术的发展, 采用反义技术抑制和封闭特定基因的表达, 已经成为研究基因功能的重要方法以及基因治疗的重要组成部分[5]. 我们针对乙酰肝素酶mRNA的起始密码区设计合成了反义寡脱氧核苷酸, 通过硫代磷酸化修饰增强其稳定性和抗酶解能力. 乙酰肝素酶反义寡核苷酸能够在不同水平下调乙酰肝素酶的表达, 能够确实有效地封闭乙酰肝素酶的表达, 可用于特异性地阻断乙酰肝素酶表达以研究其功能并进行反义治疗. 我们发现, 乙酰肝素酶反义寡核苷酸转染人胃癌细胞株SGC7901后, 抑制了SGC7901细胞株的生长, 促进了SGC7901细胞株的凋亡. 同时还发现, 乙酰肝素酶反义寡核苷酸抑制了FasL基因和蛋白的表达, 促进了Fas基因和蛋白的表达, 导致胃癌细胞凋亡. 证实了乙酰肝素酶反义寡核苷酸可以通过抑制FasL的表达和促进Fas的表达而导致人胃癌细胞株SGC7901凋亡. 但凋亡率并不随着反义寡核苷酸浓度的升高而升高, 说明还有其他机制参与了胃癌细胞凋亡的调节, 有待于进一步研究.
| 1. | Ikeguchi M, Fukuda K, Yamaguchi K, Kondo A, Tsujitani S, Kaibara N. Quantitative analysis of heparanase gene expression in esophageal squamous cell carcinoma. Ann Surg Oncol. 2003;10:297-304. [PubMed] [DOI] |
| 2. | Ginath S, Menczer J, Friedmann Y, Aingorn H, Aviv A, Tajima K, Dantes A, Glezerman M, Vlodavsky I, Amsterdam A. Expression of heparanase, Mdm2, and erbB2 in ovarian cancer. Int J Oncol. 2001;18:1133-1144. [PubMed] [DOI] |
| 4. | Dechant MJ, Fellenberg J, Scheuerpflug CG, Ewerbeck V, Debatin KM. Mutation analysis of the apoptotic "death-receptors" and the adaptors TRADD and FADD/MORT-1 in osteosarcoma tumor samples and osteosarcoma cell lines. Int J Cancer. 2004;109:661-667. [PubMed] [DOI] |