基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-01-15; 12(1): 93-96
在线出版日期: 2004-01-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i1.93
幽门螺杆菌对肝细胞系HepG2 cyclinD1, PCNA mRNA表达的影响
张艳, 范学工, 田雪飞, 黄燕
张艳, 范学工, 田雪飞, 黄燕, 中南大学湘雅医院传染科 湖南省长沙市 410008
张艳, 女, 1969-08-18生, 湖南衡阳人, 汉族. 1992年衡阳医学院本科毕业, 1999年南华大学(原衡阳医学院)微生物学硕士研究生毕业, 现为湘雅医院传染病学2001级博士研究生. 主要从事幽门螺杆菌方面的研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30271171; 湖南省自然科学基金资助项目, No. 01jjy2114; 湖南省卫生厅科研基金资助项目, No. 00022.
通讯作者: 范学工, 410008, 湖南省长沙市, 中南大学湘雅医院传染科. xgfan@hotmail.com
电话: 0731-4328926 传真: 0731-4127332
收稿日期: 2003-04-15
修回日期: 2003-05-01
接受日期: 2003-06-20
在线出版日期: 2004-01-15

目的: 研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)处理对肝细胞系HepG2 cyclinD1, PCNA mRNA表达的影响.

方法: 将H. pylori与HepG2共同培养1 h、3 h、6 h、12 h和24 h, 采用半定量RT-PCR方法分析共培养不同时间后HepG2 cyclinD1, PCNA mRNA的表达水平.

结果: CagA+H. pylori与HepG2细胞共同孵育1 h后, 即可见cyclinD1 mRNA表达升高, 3h达高峰, 约为对照的4.0倍(P<0.01); 共同孵育3 h后即可见PCNA mRNA表达升高, 6 h达高峰, 约为对照的2.0倍(P<0.05). 而CagA-H. pylori和HepG2细胞共同孵育后, 未见两基因的表达升高.

结论: CagA+H. pylori能诱导HepG2 cyclinD1, PCNA mRNA表达升高, 提示其在肝癌的发生中起一定作用.

关键词: N/A
引文著录: 张艳, 范学工, 田雪飞, 黄燕. 幽门螺杆菌对肝细胞系HepG2 cyclinD1, PCNA mRNA表达的影响. 世界华人消化杂志 2004; 12(1): 93-96
Influence of H. pylori on cyclinD1 and PCNA mRNA expression in HepG2 cell line
Yan Zhang, Xue-Gong Fan, Xue-Fei Tian, Yan Huang
Yan Zhang, Xue-Gong Fan, Xue-Fei Tian, Yan Huang, Department of Infectious Diseases, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No 30271171, Nature Scientific Foundation of Hunan Province, No. 01jjy2114, and the Scientific Research foundation of Health Department, Hunan Province, No.00022.
Correspondence to: Xue-Gong Fan, Department of Infectious Diseases, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China. xgfan@hotmail.com
Received: April 15, 2003
Revised: May 1, 2003
Accepted: June 20, 2003
Published online: January 15, 2004

AIM: To observe the effects of Helicobacter pylori (H. pylori) on cyclinD1 and PCNA mRNA expression in a human hepatoma cell line HepG2.

METHODS: H. pylori was co-cultured with HepG2 for 1, 3,6, 12 and 24 h. The cyclinD1 and PCNA mRNA expression was detected by semi-quantitative RT-PCR.

RESULTS: When HepG2 cells were cocultured with H. pylori CagA+ strain, the amount of cyclinD1 mRNA was increased 4.0-fold by 3 h and PCNA mRNA was increased 2.0-fold by 6 h, compared with that of uninfected control. Neither cyclinD1 mRNA nor PCNA mRNA of the HepG2 cells was increased after incubation with H. pylori CagA- strain.

CONCLUSION: H. pylori can induce increasing expression of cyclinD1 and PCNA mRNA in HepG2, which may play some roles in the development of hepatocellular carcinoma.

Key Words: N/A
0 引言

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)在胃十二指肠疾病中的病因作用已得到人们的广泛共识[1-17]. 近年的若干研究发现, H. pylori与某些肝脏疾病的发生相关[18-23]. 我们新近的工作证实, 肝癌患者肝组织存在螺杆菌感染, 通过测序表明, 该螺杆菌16SrDNA与H. pylori 16SrDNA具有99%的同源性[24]. 我们采用体外肝细胞和H. pylori共培养, 并测定H. pylori作用后肝细胞系细胞周期素D1(cyclinD1)和增生细胞核抗原(PCNA)mRNA的表达, 以进一步探讨H. pylori在肝癌发生中的可能作用.

1 材料和方法
1.1 材料

ATCC49503(CagA+)为本室保存的H. pylori国际标准株, CC020821为临床株, 由本室鉴定为CagA-. 人肝细胞系HepG2购自上海细胞生物研究所. H. pylori菌株培养按我室建立的H. pylori培养方法进行[25]. 3 d后收集细菌, 用0.01 moL/L PBS洗下菌落, 紫外分光光度仪测定细菌浓度(1A660≈1×1011CFU/L), 用含20 mL/L胎牛血清的DMEM培养基(不加双抗)调H. pylori终浓度为1×1011CFU/L. HepG2采用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃、50 mL/L CO2温箱培养, 2-4 d更换培养基1次, 1: 3常规传代培养, 取对数生长期细胞进行实验.

1.2 方法

H. pylori与HepG2的共同孵育. 细胞以1×106/孔密度接种至6孔细胞培养板, 置于37 ℃, 50 mL/L CO2环境中培养24 h, 弃去原有细胞培养液, 加入DMEM培养基稀释的H. pylori菌液, 使细菌与细胞数之比为100: 1. 对照孔不加细菌, 只加含20 mL/L胎牛血清的DMEM. 分别于1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h收集细胞, 收集之前用预冷PBS洗3次. 每个时间点重复4孔. 细胞总RNA的提取按TRIzol(Gibco)RNA提取试剂盒说明进行操作, 紫外分光光度计测定总RNA浓度, A260/A280比值均在1.8-2.0之间, -70 ℃冰箱保存. PCR引物根据GenBank中人cyclinD1, PCNA, -actin cDNA序列进行设计, 由上海Sangon生物工程公司合成(表1). 逆转录合成cDNA第一链: 每个反应管加2 g总RNA, Oliga(dT)15 1 L, 用DEPC水补至总体积12 L后, 70 ℃ 5 min, 冰上骤冷后加入5×buffer 4 L, 20 MU/L RNA酶抑制剂1 L, 10 mmoL/L dNTP 2 L, 200 MU/L M-MuLV 1 L 200MU/L, 37 ℃保温1 h后, 94 ℃灭活5 min, 冰上骤冷后进行PCR或-20 ℃保存. PCR扩增反应总体积50 L, 其中10×Buffer 5 L, 4种dNTP各200 moL/L, Tag酶1 U, cyclinD1及-actin, PCNA及-actin引物各0.5 moL/L, 模板cDNA5 L, 余下体积用无菌双蒸水补足. 在DNA扩增仪(PE480)上94 ℃预变性4 min后进行扩增, 最后72 ℃延伸5 min. 取PCR产物5 L在15 g/L琼脂糖凝胶(含0.5 mg/L溴化乙锭)上电泳, 紫外照相, 应用美国Stralagene公司Eagle EyeII图像分析处理系统对电泳带密度进行扫描, 获各条带光密度, 然后算出每一种基因的相对表达水平. 计算式如下: 某基因的相对表达水平= 该基因RT-PCR产物电泳条带的密度/-actin RT-PCR产物电泳条带的密度.

表1 PCR引物序列、反应条件及扩增的目的片段大小.
基因引物序列PCR反应条件目的片段大小
cyclinD1TGGATGCTGGAGGTCTGCGAGGAA94 ℃ 1 min, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min573 bp
GGCTTCGATCTGCTCCTGGCAGGC35 cycle
PCNAGCTGACATGGGACACTTA94 ℃ 1 min, 56 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min610 bp
CTCAGGTACAAACTTGGTG35 cycle
β-actinCCAGCCATGTACGTTGCTATC94 ℃ 1 min, 55 ℃或56 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min150 bp
CAGGTCCAGACGCAGGATGGC35 cycle

统计学处理 实验数据mean±SD表示, 多样本均数比较用单因素方差分析(one-way ANOVA), 多个实验组与一个对照组的两两比较用最小显著差法(the least significant difference, LSD)分析. 全部资料上机经SPSS软件包处理, P<0.05为统计学上差异有显著性.

2 结果
2.1 cyclinD1 mRNA表达

未经H. pylori处理时, HepG2 cyclinD1 mRNA有较弱表达. 将每一泳道中cyclinD1及-actin基因PCR扩增条带进行凝胶扫描后图像分析发现, 加入CagA+H. pylori与细胞共同孵育1 h后, 即可见cyclinD1 mRNA表达升高, 3 h达高峰, 约为对照的4.0倍(mean±SD分别为0.98±0.04, 0.24±0.02, P<0.01). 而CagA- H. pylori菌液和HepG2细胞共同孵育后, 未见cyclinD1 mRNA表达升高(图1, 2).

图1
图1 RT-PCR扩增HepG2 cyclinD1 mRNA表达结果. M: 100 bp相对分子质量参照标准; 1: 阴性对照; 2-6:CagA+H. pylori 处理后24 h, 12 h, 6 h, 3 h, 1 h; 7:CagA-H. pylori 处理; 8: 未处理HepG2细胞.
图2
图2 幽门螺杆菌对HepG2 cyclinD1 mRNA表达的影响.
2.2 PCNA mRNA表达

未经H. pylori处理时, HepG2 PCNA mRNA有表达. 将每一泳道中PCNA及-actin基因PCR扩增条带进行凝胶扫描后图像分析发现, 加入CagA+H. pylori与细胞共同孵育3 h后, 即可见PCNA mRNA表达升高, 6 h达高峰, 约为对照的2.0倍(mean±SD分别为1.04±0.06、0.54±0.02, P<0.05). 用CagA-H. pylori 处理后未见PCNA mRNA表达升高(图3, 4).

图3
图3 RT-PCR扩增HepG2 PCNA mRNA表达结果. M: 100 bp相对分子质量参照标准; 1: 阴性对照; 2: 未处理HepG2细胞; 3: CagA-H. pylori处理; 4-8: CagA+H. pylori 处理后1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h,
图4
图4 幽门螺杆菌对HepG2 PCNA mRNA表达的影响.

随着处理时间的延长, cyclinD1、PCNA mRNA表达量呈一下降趋势.

3 讨论

近年来, 螺杆菌感染与人和动物胃、肝、肠疾病的关系愈来愈引起相关领域学者们的兴趣和重视. H. pylori作为人消化性溃疡、慢性胃炎的主要病因已被确认, 其与胃癌的密切关系亦为许多研究所肯定. H. pylori与肝脏疾病是否有关以及是否引起肝细胞损伤亦引起了研究者们的关注. Ponzetto et al[20,26]研究发现, HBV, HCV感染者H. pylori IgG抗体阳性率明显高于对照组. Dore et al[27]报道肝硬化患者H. pylori血清IgG阳性率比无症状的献血者要高. 我们曾报道, 慢性乙型肝炎患者的H. pylori感染率要显著高于一般人群, 且感染H. pylori的乙肝患者HBV DNA复制水平明显增高[28]. 国外学者在慢性胆囊炎、原发性硬化性胆管炎(PSC)、原发性胆汁性肝硬化(PBS)、原发性胆管癌和原发性肝癌患者的胆汁、胆囊和肝组织中均检测到了螺杆菌16SrDNA, 测序证明与H. pylori有97%-99%同源性[18-23]. 新近, 我们亦从9例(9/15)原发性肝癌患者的肝组织中发现了螺杆菌16SrDNA, 测序证明与H. pylori 16SrRNA有99%同源性[24]. Wadstrom et al[29]还用电镜和免疫组化方法在原发性硬化性胆管炎(PSC)患者的肝组织中观察到似H. pylori形态的弯曲状细菌. de Magalhases Queiroz et al[30]从1例肝豆状核变性患者的肝硬化标本中分离出的1株螺杆菌菌株的16SrRNA与H. pylori有99.38%的同源性, 并且经过形态特征、生化反应等鉴定认为该菌株就是H. pylori, 推测定植于胃部的H. pylori可能会从十二指肠逆行转移到肝脏或从肠腔迁移到门脉循环. 新近, 瑞典学者在用3种不同的H. pylori菌株感染C57BL/6和Balb/cA小鼠诱发胃MALT淋巴瘤的同时, 发现感染后23 mo有1例C57BL/6小鼠诱发出了肝癌[31]. 肝组织螺杆菌感染是部分病因不明慢性肝病患者的病因亦或重叠螺杆菌感染?迄今为止, 有关人类螺杆菌感染与肝胆疾病的因果关系尚缺乏系统和肯定的报道.

cyclinD1是细胞周期G1/S期监控点重要的正向调控因子, cyclinD1的作用是使Rb蛋白磷酸化而导致他与转录因子E2F的解离, 而发挥E2F转录因子的作用, 使细胞周期通过G1限制点进入S期, 导致细胞增生. 近年来, 有不少研究表明cyclinD1基因参与肿瘤的发生、发展, 并认为是一种原癌基因, 在进展期肝癌中发现有cyclinD1的过量表达, 提示cyclinD1的过量表达与肝癌进展有关. PCNA是DNA多聚酶的一种辅助蛋白, 在静止期细胞中, 其量很少, 于G1晚期开始增加, S期达到高峰, G2, M期明显下降, 他的出现与细胞增生有关, 是反映细胞增生状态、评价肿瘤恶性潜能的主要生物学指标. 我们发现, CagA+H. pylori对HepG2细胞的cyclinD1和PCNA mRNA的表达有明显的上调作用. CagA+H. pylori作用1 h后, HepG2 cyclinD1 mRNA表达升高, 3 h达高峰, 约为正常的4.0倍；在CagA+H. pylori作用3 h后HepG2 PCNA mRNA表达增加, 6 h达表达高峰, 约为正常的2.0倍, 而CagA-H. pylori未显示这一作用. 这些结果表明, CagA+H. pylori确能促进HepG2 cyclinD1和PCNA mRNA的表达. 由于cyclinD1和PCNA是肿瘤发生、发展的重要生物学指标, 因而我们认为H. pylori的CagA毒力因子在肝癌的发生上可能起一定作用.

编辑: N/A

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