病毒性肝炎 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-01-15; 12(1): 74-77
在线出版日期: 2004-01-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i1.74
乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因5的克隆
王琳, 李克, 成军, 张健, 刘敏
王琳, 李克, 成军, 张健, 刘敏, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-06-25
修回日期: 2003-07-01
接受日期: 2003-07-16
在线出版日期: 2004-01-15

目的: 为了阐明乙型肝炎病毒(HBV)感染相关疾病的发病机制, 筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白HBx反式激活新型靶基因.

方法: 以HBV X蛋白(HBx)表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞, 以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照, 提取mRNA并进行SSH分析. 对于所获基因片段序列分析表明, 其中之一为新型基因片段, 与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性, 利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对, 确定新型基因序列并命名为XTP5. 从HepG2细胞提取总RNA, 以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列.

结果: XTP5基因的编码基因序列全长为1 527个核苷酸(nt), 编码产物由508个氨基酸残基(aa)组成.

结论: HBx是一种由病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白. 应用SSH技术发现了HBx反式激活作用的新的靶基因, 这一发现, 为阐明HBx蛋白的反式激活作用及其机制, 开辟了新的研究方向.

关键词: N/A
引文著录: 王琳, 李克, 成军, 张健, 刘敏. 乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因5的克隆. 世界华人消化杂志 2004; 12(1): 74-77
Cloning and identification of human gene 5 transactivated by hepatitis B virus X protein
Lin Wang, Ke Li, Jun Cheng, Jian Zhang, Min Liu
Lin Wang, Ke Li, Jun Cheng, Jian Zhang, Min Liu, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, 100 Xisihuanzhong Road, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: June 25, 2003
Revised: July 1, 2003
Accepted: July 16, 2003
Published online: January 15, 2004

AIM: To explore the new target genes transactivated by HBx, suppression subtractive hybridization (SSH) method and to pave the way for elucidating the pathogenesis mechanism of HBV infection.

METHODS: The mRNA was isolated from HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-)-X and pcDNA3.1(-) empty vector, respectively, using SSH and bioinformatics technique, and the differentially expressed DNA sequence between the two groups was analyzed. The obtained sequences were searched for homologous DNA sequence from GenBank, one of which was a novel gene with unknown function. The new gene with no homology with known genes in this database was confirmed and electric polymerase chain reaction (PCR) was conducted for the cloning of the full-length DNA for the new gene and in conjunction with Kozak role and the exist of polyadenyl signal sequence. The reverse transcription PCR (RT-PCR) was used to amplify the new gene, named as XTP5, from the mRNA of HepG2 cells transfected.

RESULTS: The new gene was cloned in combination of molecular biological and bioinformatics methods.

CONCLUSION: HBx is a potential transactivator. A new gene has been recognized as the new target transactivated by HBx protein. These results pave the way for study on the transactivation of HBx protein.

Key Words: N/A
0 引言

哺乳类嗜肝DNA病毒的X基因编码一个小的(17 kD)多功能蛋白HBx, 他的表达除了为HBV自然感染的建立所必需, 还影响宿主的多种细胞内过程, 包括真核细胞转录因子的反式激活、DNA损伤后的修复、细胞周期检查点的调控、信号转导通路组分的干扰等, 是HBV感染后引起急、慢性肝炎、肝纤维化和肝癌的重要分子生物学基础. 本研究利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH), 对于表达HBx载体转染的HepG2细胞进行研究, 阐明了HBx蛋白反式激活作用的部分靶基因, 同时我们结合生物信息学技术(bioinformatics)克隆了HBx蛋白反式激活作用的新靶基因, 即HBx蛋白反式激活基因5(XTP5), 从而为HBx反式激活作用的研究提供新的方向.

1 材料和方法
1.1 HepG2细胞及感受态大肠杆菌

JM109为本室保存, pcDNA3.1(-)真核表达载体购自Invitrogen公司; Lipofectamine PLUS 转染试剂购自Gibco公司, mRNA Purification试剂盒购自Amersham Pharmacia Biotech, PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒, 50×PCR Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒购自Clontech, High Pure PCR Product Purification试剂盒购自Boehringer Mannheim公司, T7、SP6通用引物及pGEM-Teasy载体购自Promega公司. 乙型肝炎病毒X蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)-X由本室构建[1]. DNA序列测定由上海博亚公司完成.

1.2 方法

1.2.1 消减杂交文库的建立及克隆分析: 分别将pcDNA3.1(-)-X及pcDNA3.1(-)空载体转染HepG2细胞, 48 h后提取mRNA, 以此mRNA为模板逆转录合成双链cDNA(dscDNA), 并分别标记为Tester和Driver, 经Rsa I (一种识别4碱基序列的内切酶)消化后将Tester cDNA分为两份, 分别连接特殊设计的寡核苷酸接头Adapter 1和Adapter 2, 与过量的Driver cDNA进行2次消减杂交和2次抑制性PCR, 使Tester cDNA中特异性表达或高表达的片段得到特异性扩增. 扩增产物与pGEM-Teasy载体连接, 转化JM109感受态细菌, 在含氨苄青霉素的LB/X-gal/IPTG培养板上, 37 ℃培养18 h. 挑取白色菌落, 增菌, 以pGEM-Teasy载体多克隆位点两端T7/SP6引物进行菌落PCR扩增, 证明含有插入片段后(200-1 000 bp), 测序. 对于每一条基因片段的序列提交GenBank进行同源基因序列的搜索, 确认所得基因片段的独特性, 然后依据GenBank数据库中的同源基因片段进行电子拼接, 根据Kozak规则和终止密码子下游的多聚腺苷酸信号序列, 确定完整的编码基因序列.

1.2.2 新基因的PCR扩增与序列分析: 根据电子拼接序列的新基因序列, 设计新基因的序列特异性的引物, 利用转染了pcDNA3.1(-)-X的HepG2细胞来源的mRNA, 经过RT-PCR扩增与克隆技术, 获得阳性克隆并进行序列分析.

2 结果
2.1 mRNA的定性、定量分析

使用高质量的mRNA是保证cDNA高产量的前提. 紫外分光检测显示, 转染了真核表达质粒及空载体的HepG2 细胞mRNA分别为 4.54 g和4.23 g, A260/A280= 1.7. 10 g/L琼脂糖凝胶电泳见 mRNA为大于0.5 kb清晰慧尾片状条带, 证实mRNA质优量足.

2.2 消减杂交文库的构建与分析

dscDNA两端连接效率检测结果显示两组dscDNA已与接头高效率连接. 消减效率的鉴定结果显示: 与未消减组PCR产物相比, 消减组PCR产物中看家基因甘油三磷酸脱氢酶G3PDH基因产物大大减少, 说明所构建的消减文库具有很高的消减效率. 对差异表达基因片段进行菌落PCR扩增, 结果显示为200-1 000 bp大小不等的插入片段[6]. 挑选克隆测序并与GenBank数据库进行初步比较.

2.3 新基因的序列分析及全长基因的获得

利用美国国立卫生院(NIH)国立医学图书馆(NLM)国立生物工程中心(NCBI)建立的核苷酸序列数据库(GenBank)及其同源基因序列的搜索(BLASTN), 发现其中的1个克隆序列与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性. 电子拼接推定该基因的开放读码框架, 设计引物, 从表达HCV NS5A蛋白的HepG2细胞提取总RNA后, 进行RT-PCR, 扩增出约1 500 bp左右片段(图1), 经过测序克隆出全长基因片段, 获得HCV NS5A蛋白反式激活作用的新型靶基因, 命名为XTP5. 新基因的开放读码框架(ORF)长度为1 527个核苷酸(nt), 编码产物由508个氨基酸残基(aa)组成(图2).

图1
图1 XTP5反转录PCR扩增结果.
图2
图2 HBx反式激活靶基因XTP5核苷酸及其编码产物序列.
3 讨论

像多数病毒一样, HBV基因表达的调节主要是在转录水平上的多水平调控, 病毒借助宿主细胞的一些复制表达元件完成其生活周期及致病过程. HBx是病毒编码的主要调节成分, 参与HBV基因在肝细胞中的表达、增生和再感染[2-5]. 由于HBx不与双链DNA发生结合, 其发挥作用的普遍规律是对宿主细胞和病毒启动子转录的反式激活. 作为一个有力的转录激活子, HBx可使HBV其他基因产物转录活性增加数倍. 大量体内研究证明, HBx可激活多种基本转录因子以及RNA聚合酶包括RNA聚合酶1、2、3, NFB、NF-AT、AP-1、ATF/CREB、抑癌基因p53[6-22]. 在体外研究中HBx还可以结合一些转录元件, 包括TATA结合蛋白(TBP), TFIIB, TFIIH, RNA聚合酶亚单位RPB5[23-26]. HBx细胞内定位通常在胞质, 他还具有激活胞质内信号转导通路的活性, 特别是Ras-Raf-MAPK途径[27,28], 细胞应激介导的MEKK1-p38-JNK通路和Src酪氨酸激酶. HBx可影响早期细胞周期的调控点, 通过激活内源性细胞周期素A和周期素A依赖的胞质Src转导通路, 使细胞越过G1期而停滞在S期, 这一时期对病毒的复制是至关重要的. 而对于肝细胞的分化、增生、凋亡和肝肿瘤的转化具有重要意义.

本实验将真核表达载体pcDNA3.1(-)-X, 转染肝母细胞瘤细胞系HepG2, 并以转染空白载体的相同细胞系作为对照, 以两种转染的细胞系中提取的mRNA为起始材料, 应用SSH方法成功地构建了HBxAg反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库, 随机挑选克隆测序并与GenBank数据库进行同源性比较分析, 结果主要包括两种类型, 第一种是已知基因的序列, 与GenBank中数据高度同源, 其中包括一些已知的看家基因序列和一些与细胞生长调节密切相关的基因序列, 第二种是未知基因序列, 共获得9个差异表达的未知序列[1]. 对其中的一个未知功能基因序列, 我们采用生物信息学方法进行电子拼接分析, 获得了其全长基因序列, 命名为XTP5, 是存在于肝细胞内HBx反式激活的新的靶基因, 我们已构建其哺乳动物细胞和酵母细胞表达载体, 为进一步研究该基因的生物学功能和对X蛋白的致病作用提供线索.

编辑: N/A

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