病毒性肝炎 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-01-15; 12(1): 42-46
在线出版日期: 2004-01-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i1.42
乙型肝炎病毒基因组高变区界定的初步研究
董菁, 成军, 杨倩
董菁, 成军, 杨倩, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
董菁, 男, 1969-02-07生, 河北省徐水县人, 汉族, 2001年北京大学医学部毕业, 医学博士, 主治医师, 主要学术研究方向: 乙型肝炎病毒分子生物学与病毒性肝炎的治疗.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. C30070690, C39970674, C03011402; 归国留学人员科研启动基金资助项目, No. 98H038.
通讯作者: 成军, 北京市, 100039, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-06-25
修回日期: 2003-07-01
接受日期: 2003-07-16
在线出版日期: 2004-01-15

目的: 探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因组是否存在高保守区或高变区, 并探讨前-前-S基因和前-X基因的存在方式.

方法: 自GenBank中按血清型搜索符合要求的HBV全基因组序列, 并应用Vector 6.0版软件进行核苷酸序列同源性的分析和比较.

结果: GenBank中搜索出28个adr血清型和22个adw血清型HBV病毒株全基因组, 比较后发现2种血清型的核苷酸序列总一致率分别为76.6%和73.9%; adr血清型病毒株存有高度变异区和高度变异区, 一致率分别为54.5%和92.1%; adw血清型基因组内部含有高度保守区, 一致率为85.0%, 不含有高度变异区. 前-前-S区的存在是较为普遍的现象, 而前-X区的编码具有adr血清型特异性特点, 在某些病毒基因组中, 因为存在A2608 →C/T和C/A2733 →T替换突变, 导致其前-X基因编码区起始密码子突变, 因此部分HBV基因组无前-X基因结构区.

结论: HBV基因组内部可能存在高度保守区, 前-前-S区的存在是一个重要的现象, 而前-X编码区具有adr血清型特异性的特点.

关键词: N/A
引文著录: 董菁, 成军, 杨倩. 乙型肝炎病毒基因组高变区界定的初步研究. 世界华人消化杂志 2004; 12(1): 42-46
Identification and characterization of high variable regions in hepatitis B virus genome of adr and adw serotypes
Jing Dong, Jun Cheng, Qian Yang
Jing Dong, Jun Cheng, Qian Yang, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. C30070690, C39970674, C03011402.
Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: June 25, 2003
Revised: July 1, 2003
Accepted: July 16, 2003
Published online: January 15, 2004

AIM: To identify a hypervariable region or a hyperconservative region in hepatitis B virus (HBV) genome and to study the pre-X region and the pre-pre-S region.

METHODS: Full-length of HBV genomes deposited in GenBank were searched and compared for their identity and homology. According to their sequences, the HBV genomes of adr or adw serotypes were selected. The Vector 6.0 software was used to compare the identity and difference among the strains of HBV genomes.

RESULTS: Twenty-eight strains of HBV genome in GenBank belong to adr serotype HBV genome, and 22 strains belong to adw serotype. After being compared, the total identity rates were 76.6% and 73.9%, respectively. There might be a hypervariable region and a hyperconservative region in adr serotype HBV genome, with the regional identity rate of 54.5% and 92.1%, respectively. There might be a hyperconservative region in adw serotype HBV genome, with the regional identity rate of 85.0%. Region coding pre-pre-S gene was popular in the strains. Pre-X region might be a serotype-specific gene. A2608 C/T and/or C/A2733 T replacement mutation resulted in disability of coding pre-X gene.

CONCLUSION: There may be a hyperconservative region in HBV genome. Pre-pre-S gene and pre-X gene are worthy of further study.

Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)基因组全长在3 200个核苷酸(nt)左右, 为部分双链的DNA病毒. Galibert et al[1-2]于1979年发表了HBV基因组的第一个全长核苷酸序列, 长度为3 182 nt, 为ayw血清型, 我国学者[3-4]于1984年报道了中国大陆流行的adr血清型全基因序列. Gelibert et al最初的研究将HBV基因组划分出4个开放读码框架(ORF)[5], 分别命名为S、C、P、X区, 之后又先后发现两个直接重复序列(DR I和DR II)[6]、四个启动子区和两个增强子[7-8]. 1993年, Blum et al[9]和Carman et al[10]提出HBV在患者体内是以准种(quasispecies)形式存在. 多年来, 世界各地对于HBV基因组的一些热点突变区进行了研究, 并部分阐明了这些突变的生物学意义和临床医学意义. HBV基因组的各个区段的变异速度和程度可能是不同的. 但是, 从整个基因组水平来讲, 目前还不清楚HBV基因组各个区段的保守或者变异是否是一致的. 随着对HBV全基因组序列的测定以及核苷酸数据库的积累, 使得我们对于HBV全基因组的比较成为可能. 本文参考丙型肝炎病毒(HCV)和人免疫缺陷病毒(HIV)高变区(hypervariable region, HVR)的研究方法[11-13], 对于我们克隆的5株HBV全基因组, 以及GenBank中收录的HBV全基因组序列进行分析、比较, 试图阐述HBV基因组内是否存在基因序列高变区或保守区.

1 材料和方法
1.1 HBV全基因组的克隆的选择

进入美国国立卫生院(NIH)网站, 在GenBank中搜寻HBV基因组序列, 之后进一步限定血清学分型为adr和adw血清型, 将搜寻结果下载备用, 其中也包括本研究组以往报告[14-15]的全基因组序列.

1.2 核苷酸序列一致性分析

应用Vector 6.0版软件对下载的存储于GenBank中不同血清型的HBV核苷酸序列进行比较. 比较前将原存储于GenBank中的HBV基因组序列进行了初步处理, 即参考Gunther et al[16]报告的HBV排列顺序和我们以前的报告[14-15]的全基因组序列的排列方式, 自DR I(5'-TTC ACC TCT GC-3')上游3个核苷酸(TTT)为起始点, 以第一个T为记数1, 之后将所有参加比较的序列重新排列, 即各序列均以5'- TTT TTC ACC TCT GC-3'为开始, 统一排列, 保证了各序列之间的可比较性.

该软件比较后提供两个数据: 阳性率和一致率, 阳性率是选定区域推定序列的核苷酸序列数目与区域总长度之比, 推定序列是软件自动比较所有序列, 参考每个核苷酸位点上每个克隆的编码方式, 由大多数克隆(多于70%)编码的核苷酸组成的一致性序列, 阳性率用于展示区域内部的插入突变或/和缺失突变, 以及较少见的单一位点多种核苷酸编码方式; 一致率是选定区域全部克隆均为一致的核苷酸数目与最长的单一克隆核苷酸序列数目之比, 表示该段区域核苷酸序列一致性, 用于展示区域内部的替换突变或/和缺失突变. 各区段之间的划分是在计算机软件比较的基础上, 人为划定的, 最短的分区至少大于200 nt, 不选择阳性率小于97%的区域, 因为这提示该段内有较长的缺失突变.

1.3 前-X区及前-前-S区开放读码框架(ORF)的判读

将本研究组最近发现的前-X区[17]和前-前-S区[18]基因序列加入到上述比较序列中, 主要用于筛检出新的编码前-X区和前-前-S区已知克隆.

2 结果
2.1 在GenBank中搜寻的HBV基因组结果

以往的研究[14-15]我们获得了5个HBV全基因组克隆, 分别命名为G683-A1、G683-A2、G683-A3、G376-A6和G376-A7, 测序结果在NIH GenBank中的序列号分别为AF363961、AF363962、AF363963、AF384371和AF384372, 均为adr血清型. 经过在GenBank中按不同血清型进行搜寻, 获得的adr血清型28个克隆, 最长的克隆长度为3 215 nt; 另23个克隆序列号如下: D12980、D00630、X14193、D16665[19]、AY123041[20]、AB033550[21]、AF458665、AF411412、AF458664、AF411410、AF411409、AF411408、AB042285[22]、AB042284、AB042283、AB026815[23]、AB026814、AB026813、AB026812、AF286594、M38636、AF068756、V008676, 其中来自中国大陆11例、日本13例、韩国3例、泰国1例.

adw血清型搜寻结果共22个克隆, 最长的克隆长度为3 221 nt, 其克隆号如下: AY152726、AB059661、X51970、D00331[24]、D00330、AB033553[21]、AB033552、AB033551、M57663[25]、AB033557、M54923、AB033555、AB033554、AF282918、AF282917、AF100309、AF100308、X98077、AB059660、AF537372、AY034878、AF536524, 其中, 来自中国大陆4例、美国6例、日本7例、瑞士1例、印度尼西亚3例、Goettingen 1例.

2.2 核苷酸序列的一致性分析

按克隆G683-1(AF363961)为比较的参照标准, 即以5'- TTT TTC ACC TCT GC-3'为开始, 各ORF的位置如下: 前-C/C基因位置为3 209-3 215 nt和1-632 nt, P基因位置为487-3 018 nt, 前-S1、前-S2和S基因位置为1028-2230 nt, X基因为2 769-3 215 nt和1-18 nt; 另前-X区基因位于2 601-2 768 nt, 前-前-S区基因位于893-1 027 nt. 按不同血清型进行的一致性比较结果见表1和表2, 所选择序列群组中, adr血清型的病毒株总一致率为76.6%, adw血清型的病毒株总一致率为73.9%; adr血清型1 451-1 883 nt区域的阳性率为100%, 一致率为92.1%, 提示为高保守区, 相应的, adw血清型1 585-2 165 nt区域的阳性率为99.7%, 一致率为85.1%, 相对于总一致率的73.9%, 该段相对较为保守.

表1 HBV adr血清型基因组序列一致性比较结果.
阳性率(%)一致率(%)
1-78210080.2
783-1 45099.954.5
1 451-1 88310092.1
1 884-3 01299.283.4
3 013-3 21810067.0
总计99.776.6
表2 HBV adw血清型基因组序列一致性比较结果.
阳性率(%)一致率(%)
1-22110080.5
222-1 58497.967.8
1 585-2 16599.785.0
2 166-2 53998.969.3
2 540-3 21799.377.0
总计98.873.9

adr血清型783-1 450 nt区域阳性率为99.9%, 一致率为54.5%, 较总一致率76.6%明显为低, 我们初步将此区定义为HBV adr血清型的高变区; adw血清型222-1 584 nt区域阳性率为97.9%, 一致率为67.8%, 较总一致率73.9%略低.

2.3 前-前-S区和前-X区比较结果

将文献[17]和[18]中推断的前-前-S和前-X区基因序列输入软件中进行编码分析, 结果发现: adr血清型28个克隆中, 27个克隆在前-前-S区起始密码子处编码为ATG, 仅有来自泰国的克隆AF068756在起始密码子编码为ATA; 这27个克隆之后自起始密码子ATG至前-S1基因起始密码子ATG之间的区域共135 nt, 中间无终止密码子, 提示27个克隆均编码前-前-S基因. adr血清型28个克隆中, 25个克隆在前-X区起始密码子处编码为ATG, 中国上海Wen et al报告的6个HBV全基因组病毒株中, 2个病毒株(AF458665和AF41108)编码CTG, 泰国病毒株AF068756在此位点的编码为TTG, 即此位点发生A2608→C/T替换突变; 前-X区起始密码子处编码为ATG的25个病毒株中, 14株自起始密码子ATG至X基因起始密码子ATG之间的区域的168 nt中无终止密码子, 提示这14个克隆均编码前-X基因; 另11株克隆在2733位点表现为C/A2733→T的替换突变, 导致编码终止密码子TGA. adr血清型28个克隆中前-前-S区的阳性率为100%, 一致率为85.2%; 前-X区阳性率为99.4%, 一致率为81.5%, 比adr血清型总一致率的76.6%高.

adw血清型22个克隆中, 16个克隆在前-前-S区起始密码子处编码为ATG, 来自美国的6个病毒株中有4株(AY152726、AY034878、AF537372和AF536524)在该位置编码子为AGG, 来自Goettingen的病毒株(X51970)编码AGG, 来自日本的一株(AB033557)编码ATA. 16个前-前-S区起始密码子处编码为ATG的病毒株在之后的135 nt中无终止密码子, 提示16个克隆均编码前-前-S基因. adw血清型22个克隆中前-前S区的阳性率为98.5%, 一致率为74.8%, 与adw血清型总一致率的73.9%极为相近. adw血清型22个克隆中, 在前-X区起始密码子处均不表现ATG, 13个病毒株编码CTG, 9个克隆编码TTG, 提示前-X区可能是adr血清型特异性的一种表现.

根据本研究分析结果, 将HBV基因组结构图重新定义如图1.

图1
图1 HBV基因组基因结构修正示意图. 其中adr血清型含有前-X基因, 而adw血清型不含有前-X编码区; 这两种血清型多包含前-前-S编码区.
3 讨论

本研究组在以往的研究中着重研究了HBV准种现象[14,15,26-37], 研究的结果提示HBV在慢性乙型肝炎患者体内是以准种群形式存在的. 借鉴关于HCV和HIV准种研究的成果, 随之提出的新问题是HBV是否也象HCV和HIV基因组序列一样存在有序列高保守区或/和高变区? 本文应用新的序列分析软件, 利用GenBank中的信息资源, 对来自多家实验室的关于HBV基因组的数据进行了比较分析, 结果提示HBV存在有高保守区域.

目前在美国国立卫生院的GenBank中, 存储了200多个HBV全基因组序列, 本研究初始以限定条件搜索出符合条件的HBV基因组序列共50株, 其中adr血清型28株, adw血清型22株, 经过比较发现, 28株adr血清型的病毒株总一致率为76.6%, 22株adw血清型的病毒株总一致率为73.9%, 提示近四分之一的序列位点表现为编码的多样性, 基因位点包括替换、缺失和插入突变等多种突变形式. 我们又进一步分析了HBV两种血清型的节段差异性, 在计算机软件分析的基础上, 人工的分段展示各区域的一致率, 条件是: (1)选择区域至少大于200 nt; (2)避免选择区域为某一克隆株发生完全缺失突变的部位; (3)根据一致率最大法或最小法确定区域. 结果发现adr血清型的病毒株可被分为3类区域: (1) 局部区域一致率远高于总一致率的区域, 1 451-1 883 nt之间的一致率高达92.1%, 可将该区域定义为高度保守区; (2)局部区域一致率与总一致率相近的区域, 如1-782 nt、1 884-3 012 nt和3 013-3 218 nt等区域, 一致率分别80.2%、83.4%和67.0%, 与总一致率的差距在10%以内; (3)局部区域一致率远低于总一致率的区域, 如783-1 450 nt, 该段区域的一致率仅为54.5%, 可将该区域定义为高度变异区.

为了解上述在adr血清型病毒株比较的过程中所定义出的高度保守区和高度变异区, 我们又搜索出22株adw血清型病毒株进行比较, 结果未发现上述的高度变异区, 但有区域的一致率远大于总一致率, 即1 585-2 165 nt区, 一致率为85.0%; 其余的区域一致率与总一致率的差异不超出10%. 初步分析认为adw血清型病毒株不包含基因高度变异区, 高度变异区可能是adr血清型病毒株的一种特异性表现. 结合HBV基因组的ORF分区, adr血清型的病毒株的高变区涵盖了HBV前-前-S区和前-S区[38], P基因的末段结合蛋白和间隔区, 而高保守区位于前-S区后半部分和S基因主蛋白的N端部分, 以及P基因的部分间隔区编码基因. adw血清型病毒株高保守区位于S基因主蛋白的大部分和P基因的间隔区和逆转录酶区N端部分.

我们以往的研究[17]在分析所获得的5个克隆[14-15]的过程中, 在X区之前发现还存在一个ORF, 长度168 bp, 编码56 aa, 该多肽分子量约为6.2 kD, 有15个疏水氨基酸, 命名该区为前-X区. 早期有学者[39-41]报告了前-X区的存在, 但不认为该现象是一种广泛存在的情况. 我们针对这50个病毒株的研究揭示: adr血清型28个克隆中, 25个克隆在前-X区起始密码子处编码为ATG, 前-X区起始密码子处编码为ATG的25个病毒株中, 14株自起始密码子ATG至X基因起始密码子ATG之间的区域的168 nt中无终止密码子, 提示这14个克隆均编码前-X基因, 另11株克隆发生C/A2733→T的替换突变, 导致前-X区表达被提前终止. adw血清型22个克隆中, 在前-X区起始密码子处均不表现ATG, 提示前-X区可能是adr血清型特异性的一种表现. 不表达前-X多肽的病毒株均是因为在前-X区起始密码子发生替换突变, 突变形式为A2608→C/T. adr血清型28个克隆中前-X区阳性率为99.4%, 一致率为81.5%, 比adr血清型总一致率的76.6%高, 提示此段相对还是比较保守的. 来自多个研究组的HBV病毒株基因组中均编码前-X基因, 我们认为这说明前-X基因是事实存在, 是被忽视的一段重要序列. 被忽略的主要原因在于: (1)获得的HBV基因组序列的数目尚少, 不足以展示HBV序列的多样性; (2)前-X区为adr血清型特异性现象, 在既往的研究中缺少对adr血清型HBV基因组的深入研究; (3)A2608→C/T替换突变(AF458665、AF068756等)、C/A2733→T替换突变(D12980、D00630等)以及上述2个位点的双替换突变(AF411408)导致前-X区多肽表达被终止, HBV编码的X蛋白自然自下一个ATG开始. 因此针对前-X区域的替换突变的研究仍需要进一步加强.

我们以往的研究[18]在分析所获得的5个克隆[14-15]的过程中, 在前-S1区之前发现还存在一个ORF, 长度135 bp, 编码45 aa, 命名为前-前-S区. 关于前-前-S基因的存在, 本文较以前又进一步进行了分析, 发现研究的50个病毒株中, 一共有43个克隆编码前-前-S基因, 不表达的7个克隆中5个克隆在前-前-S区起始密码子编码ATG处编码AGG, 而另2个克隆编码ATA. adr血清型28个克隆中前-前-S区的阳性率为100%, 一致率为85.2%, 高于adr血清型病毒株的总一致率76.6%; adw血清型22个克隆中前-前-S区的阳性率为98.5%, 一致率为74.8%, 与adw血清型总一致率的73.9%极为相近. 这些数据说明adr血清型病毒株在前-前-S区(893-1 027 nt)是接近高度保守的, 是在高度变异区(783-1 450 nt)中的高保守区; adw血清型病毒株前-前-S区的一致率为74.8%, 高于该区域(222-1 584 nt)的一致率67.8%, 也提示前-前-S区是相对保守的.

重新定义S基因和X基因的范围是由于这2个基因产物在病毒的生活史中起重要作用,而且早先的研究发现S基因产物[42-43]、截短型S基因产物[44-45]和X蛋白[46-47]具有反式激活作用, 这种作用可能通过激活癌基因导致肿瘤的发生[48]. 重新定义基因区域的一项重要工作是确定基因的启动子区域, 杨倩 et al[49-50]的研究发现前-前-S区和前-X区之前的核苷酸序列具有启动子作用, 这些研究结果为证实前-前-S区和前-X区的存在提供了具有说服力的直接证据.

总之, 我们应用现有的计算机软件对GenBank中存储的50个HBV病毒株全基因组进行了深入分析, 结果发现adw血清型病毒株存有高度变异区和高度保守区, adr血清型病毒株基因组内部不含有高度变异区, 高度变异区一致率仅54.5%, 较总一致率76.6%明显为低. 围绕前-前-S区和前-X区的研究发现前-前-S区的存在是较为普遍的现象, 而前-X区的编码具有adr血清型特异性特点, A2608→C/T和C/A2733→T替换突变是导致前-X基因编码失败的主要原因. 结合上述结果, 我们修正HBV基因结构图见图1, 进一步的分子生物学和前-前-S区和前-X区抗体流行病学研究正在进行之中.

编辑: N/A

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