成体干细胞有多向分化潜能, 可以横向分化为不同类型的特化细胞, 甚至逆分化为更原始的干细胞. 本文介绍了近年来成体干细胞"横向分化"潜能、分化机制, 对成体干细胞横向分化为肝脏细胞的研究进展及存在问题进行了讨论.
关键词: N/A
引文著录: 何念海, 赵文利, 王宇明. 成体干细胞可塑性及对肝脏的重建作用. 世界华人消化杂志 2004; 12(1): 205-208
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: August 7, 2003
Revised: August 20, 2003
Accepted: September 18, 2003
Published online: January 15, 2004
0 引言
干细胞研究因其在理论和实践上的重要意义, 近年来成为生物医学领域研究的热点. 干细胞是一种未分化细胞, 其基本特性为: 具有自我复制能力, 产生出与自己完全相同的子细胞; 分化为超过一种以上的功能细胞. 根据分化阶段不同可分为来源于受精束、胚胎内细胞团细胞或早期胚胎原始的胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)和来源于成年动物或未成年动物组织的成体干细胞(adult stem cells, ASC). 目前ESC的研究由于受伦理学争议、免疫排斥、实验技术限制以及其本身的成瘤性等影响, 阻碍了其在临床治疗中的应用. 同时ASC的研究异军突起, 成为近年来研究的热点, 本文介绍了ASC"可塑性"、分化机制、关于ASC向肝脏细胞分化的研究进展及其在肝脏疾病方面的潜在应用, 并对目前研究中存在问题进行了讨论.
1 ASC的可塑性
ASC普遍存在于人体的各种器官, 如造血干细胞(hem-atopoietic stem cells, HSC)、肝干细胞、神经干细胞(neural stem cells, NSC)、肌肉干细胞、骨髓间质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MMSC)和表皮干细胞等. 这类细胞在自然条件下倾向于分化成所在组织的各种细胞, 但最近一些研究结果显示, 即使干细胞已经定向分化, 在某些条件下, ASC仍有多向分化潜能, 甚至可以打破胚层界限, 横向分化(transdifferentiation)为无关类型的成熟细胞或在特定环境下发生逆分化, 也称为ASC的可塑性(plasticity). 1999年Bjornson et al[1]将从成年小鼠前脑分离出的NSC输入丧失了造血功能的小鼠体内可以产生造血细胞; HSC可以进入脑内, 分化为神经细胞, 进入肌肉组织中可以分化为具有成熟肌肉细胞表型的细胞; 2001年Toma et al[2]从鼠皮肤分离获得的皮肤干细胞可转化为神经元细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞等; 2002年Fukuda et al[3]报道MMSC除了分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞等, 在一定条件下还可以分化为HSC、形成肌小管和肌腱.
ASC横向分化实验中也可能存在的错误. 2000年Wagers et al[4]将取自绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)转基因小鼠纯化的骨髓HSC(c-kit+Thy1.1 low Lin- Sca-1+)输给受照射受体鼠, 使受体鼠造血重建, 造血细胞为供体标志. 但在肌肉、肺、小肠、上皮细胞、肾及脑中没有发现来源于供体的特异性细胞, 如肌肉中的GFP+细胞不表达肌肉特异性标记α-actin, 肾组织中发现的GFP+细胞不表达WGA, 脑组织中GFP+细胞不表达神经元标记MAP-2等. 2002年Morshead et al[5]报道了他重复Bjornson et al[1]关于神经干细胞具有向HSC分化实验的情况, 将培养的C57BL/ 6-ROSA26lac Z转基因鼠的神经干细胞输给C57BL/5小鼠, 经检查104只小鼠31 990个造血集落, 未发现有lacZ+的造血集落. 再将从C57BL/6J-Gpila/a小鼠制备的神经干细胞注入C57BL/6J-Gpila/b小鼠, 亦未发现受体鼠造血细胞带有供体标记. 这些资料表明ASC是否具有可塑性分化的特性, 尚有待更多的论证.
2 ASC可塑性的机制
由于ASC发育分化的基因机制还不清楚, 当一类ASC跨谱系分化产生另一类组织细胞时, 究竟是先去分化(de-differentiation)进入一个更加原始可塑的状态, 然后再分化(re-differentiation), 还是不经历去分化而直接通过横向分化(trans-differentiation)变为另一类细胞, 目前尚无定论. 干细胞分化的过程包括多重复杂的反馈调节和细胞间的相互作用, 内部信号和外部信号都可以调节干细胞的分化, 其中一些信号现已被识别. 目前有关ASC可塑性调控机制主要有细胞融合学说和基因程序重组学说两种观点.
2.1 细胞融合学说
细胞融合可能导致ASC具有横向分化潜能, 向其他类型细胞分化. Terada et al[6]报道小鼠骨髓细胞与ESC融合后具有多系分化的能力. 骨髓细胞来自♀TgN(GFPU)5Nagy转基因鼠, 与♂来源的ESC共培养, 培养体系中加入全能HSC集落刺激因子(IL-3)和白细胞抑制因子(LIF), 分别支持HSC和ESC生长. 第7 d撤去IL-3, 使HSC的生长失去支持, 加入嘌啉霉素, 杀死ESC. 3 wk后, 分离出GFP+、抗嘌啉霉素的ESC样细胞. 这些细胞在体外可分化为心肌细胞, 注入重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency, SCID)小鼠可形成畸胎瘤, 检查DNA倍体型时, 11/13个类似ESC细胞系显示大约四倍体DNA, 其他两个显示近似六倍体DNA基因型. 认为HSC与ESC融合后, 使HSC具有向非造血细胞分化的能力. Pells et al[7]证明来自大脑的ASC与ESC共处于同一培养皿时会发生融合. Ying et al[8]将NSC与小鼠ESC共同培养. NSC来自ZIN40转基因小鼠[结构性表达lacZ基因和新霉素(neo)抗性基因]和oct4-GiP转基因小鼠(在多能干细胞和生殖系细胞中oct4作启动子时选择性表达GFP基因和嘌啉霉素抗性基因). ESC含有通过同源重组插入oct4位点的潮霉素抗性-单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶融合基因. 在含有G418或嘌啉霉素(pac)的选择性培养基中培养2-4 wk后杀死ESC, 其他细胞表达lacZ (neo) 或GFP(pac). 进一步研究显示细胞对潮霉素耐药, 可见到四倍体或近似四倍体核型. 这些研究提示NSC去分化回到类ESC状态是通过融合细胞自然发生的, 而不是通过固有的信号通道激活所致. Wang et al[9]进行了一系列骨髓移植重建肝脏的实验, 通过DNA印迹分析证实移植前供体细胞独有的等位基因为纯合子, 而重建的受体肝脏内肝细胞是杂合子; 通过细胞遗传学分析显示从♀鼠供体骨髓移植重建的♂鼠受体肝细胞核型为80, XXXY(二倍体和二倍体的融合)和120, XXXXYY(二倍体和四倍体的融合)核型, 证实重建肝脏细胞是供体和受体细胞融合后分化而来. 上述研究提示移植的成体细胞可能通过与体内原位组织细胞融合, 表现出靶组织的表型.
2.2 基因程序重组学说
Reik et al[10]认为细胞分化过程是基因按程序的开放与关闭的过程: 胚胎向前发育的每一个阶段, 都关闭了前一个发育阶段的一批基因, 开放了新发育阶段的一批基因. 结果是像囊胚内细胞团这样的未分化细胞, 最后分化为肌细胞、B细胞等特化细胞. Surani et al[11]用ASC在特定的微环境下背离其既定分化方向而横向分化为其他特化细胞时, 成体细胞核内诸多基因的程序, 也存在关和开的调节, 以便逐步表达特化细胞的基因, 引进计算机术语, 就是基因的程序重组(reprogramming).
ASC移植后对环境中外部信号产生反应, 通过基因程序重组而激活相应的分化通路, 产生出与植入部位相称的特定结构和代谢的细胞. 2000年Yan et al[12]从第6 d的鸡胚中分离的视网膜色素上皮细胞在neuroD诱导下发生程序重排转录光感受器基因, 表达光感受器视黄醛结合蛋白、视蛋白基因编码的视紫红质、视色素等, 从而分化为感光细胞; Kondo et al[13]发现少突胶质细胞的前体在体外特定培养条件下可发生重新程序化而形成多能神经干细胞, 后者则可分化成为神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞; 2002年Beerheide et al[14]发现将人脐带血干细胞移植入严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠肝脏后发生程序重排, 下调作为主要组织相容性复合物(MHC)的重要组成部分2-微球蛋白的表达, 使宿主免疫耐受, 从而存活下来; Petrova et al[15]在血管内皮细胞内将基因重新编程, 使转录因子prox-1过度表达可诱导淋巴管内皮细胞特异基因的转录, 同时抑制将近40%的血管内皮细胞特异基因的表达, 使其向淋巴管内皮细胞分化.
最近Dean et al[16]研究认为: 程序重组是通过对基因组的修饰实现的. 一系列复杂的修饰包括DNA甲基化、染色质修饰(如核小体核心组蛋白广泛改变: 在组蛋白和其他染色质蛋白的氨基酸尾端进行特殊氨基酸残基修饰, 影响转录)、组蛋白共价修饰(乙酰化、甲基化、磷酸化作用). 通过上述修饰调节染色质结构, 对基因组程序重组、对组织特异基因的表达起决定性作用. Li et al[17] 研究发现染色质修饰的失败能导致发育过程调节障碍(如X染色体失活、基因组印迹)和各种疾病.
3 ASC向肝细胞横向分化的研究进展
ASC的横向分化潜能为肝脏疾病的治疗提供了一条新的思路. 多种供体细胞被用于肝脏重建移植试验或在体外诱导向肝细胞分化, 如胰腺上皮祖细胞、HSC、骨髓细胞、多潜能成人祖细胞(multipotent adult progenitor cells, MAPCs)、MMSC等. 尽管迄今的研究结果表明, 这种转化后的细胞增生能力有限, 尚不具备实际应用价值, 但却提供了一条重建肝细胞功能的重要思路.
3.1 胰腺上皮祖细胞
1997年Dabeva et al[18]首次报道采用不同来源的上皮细胞分化为肝细胞, 从Fischer大鼠胰腺中分离上皮祖细胞, 移植至近亲大鼠肝脏, 以二肽二酰酶Ⅳ(DPPⅣ)及白蛋白基因的表达作为鉴定指标, 发现来自胰腺的上皮祖细胞在肝内分化成肝细胞, 并可整合到肝小叶结构中表达特异性蛋白. 2001年Shen et al[19]在体外采用地塞米松、制瘤素M将分泌性胰腺肿瘤细胞诱导为表达肝细胞表型的细胞. 2002年Tosh et al[20]将小鼠胚胎期胰腺细胞或者分泌胰多肽的胰腺细胞系AR42J-B13诱导分化为肝细胞, 后者表达白蛋白、运铁蛋白、甲状腺运载蛋白等肝细胞标志.
3.2 骨髓/血液干细胞
大量研究显示骨髓细胞或纯化后的HSC均可在体内转化为肝细胞. 1999年Petersen et al[21]将Ｙ染色质Sry标志的♂供体骨髓细胞, 移植给经2-乙酰氨基芴和四氯化碳处理后的♀大鼠, 或以二肽二酰酶Ⅳ(DPPⅣ)为鉴定标志, 将阳性的骨髓细胞移植给DPPⅣ缺损的受体大鼠, 在其肝中可见供体来源的肝卵圆细胞和肝细胞. 2000年Theise et al[22]分别将♂小鼠骨髓细胞和纯化的CD34(+)lin(-) 的HSC移植入经致死剂量射线照射后的B6D2F1♀小鼠体内, 在肝内均可找到Y染色体阳性的供体细胞分化来的肝细胞, 新生肝脏中供体来源的细胞占2. 2%. 同年Lagasse et al[23]也分别将骨髓细胞和纯化的HSC通过静脉注入I型酪氨酸血症FAH(-/-)小鼠体内, 从而重建肝脏功能, 并可见供体来源的肝细胞再生, 在6 mo后供体来源的重建部分达到30%以上. 同年Theise et al[24]和Alison et al[25]在人体内进行了类似研究, 给予男性骨髓细胞后可在女性患者肝内检测到Y染色体阳性的肝细胞, 分析表明, 他们是由捐赠骨髓中的HSC发育而成的, 同样在男性患者移植入女性供体肝脏后, 可在肝内检测到由自体HSC发育来的Y染色体阳性肝细胞, 同时也发现了供体来源的胆管细胞, 其中1例由HSC来源的肝细胞高达5-40%. 2001年Krause et al[26]移植纯化HSC给小鼠后在肝脏胆管中还发现受体来源的上皮细胞.
现已从动物体内分离出骨髓细胞, 在体外定向分化培养发育成肝细胞. 2000年 Oh et al[27]分离成年大鼠骨髓细胞, 在含表皮细胞生长因子(EGF)的无血清DF(DMEM/F12)培养基中培养, 前5 d加入剂量达1 g/mL的肝细胞生长因子(HGF)诱导分化, 共培养21 d后采用RT-PCR可检测到分化后的类肝细胞内AFP、Alb和HGF的受体c-met的mRNA表达, 组化染色亦可见到细胞内AFP、Alb、CK8和CK18的表达. 2 a后Miyazaki et al[28]改用优化后的更适于向肝细胞分化的HGM培养基代替Oh et al[27]采用的DF培养基培养Wistar大鼠骨髓细胞, 再次诱导出类肝细胞, 且分化程度较诱导的肝细胞更成熟, RT-PCR监测到肝细胞分化终末阶段标志色氨酸-2, 3-二氧合酶(tryptophan-2, 3-dioxygenase)和酪氨酸氨基转移酶(tyrosine aminotransferase)的mRNA. 最近Yamazaki et al[29]改用氮胞苷刺激小鼠骨髓细胞12 h后再置于肝脏非实质细胞的滋养细胞层上培养, 并以肝衰竭患者血清、制瘤素M、地塞米松、50 ng/mL肝细胞生长因子刺激诱导, 2 wk后对细胞进行组化染色和RT-PCR均显示类肝细胞集落中可见肝细胞白蛋白、CK8、CK18和CK-19的表达.
此外将流产胎儿体内的MMSC干细胞植入人为诱发病变的实验鼠肝脏内, 发现干细胞在实验鼠体内生长为肝细胞, 病鼠肝脏恢复正常功能.
3.3 多潜能成人祖细胞
随着研究的深入, 美国明尼苏达大学医学院Reyes et al[30]领导的实验室于2001年首先报道从人和小鼠骨髓中纯化和扩增出多潜能成人祖细胞(multipotent adult progenitor cells, MAPCs), 该细胞具有如下特点: (1)数量少, 状态原始; (2)增生能力强, 可长期稳定传代; (3)更强的分化潜能. 可分化为间充质来源的细胞(骨、软骨、脂肪、基质细胞、肌肉), 也可诱导分化为神经外胚层表型和功能细胞, 也可以分化为具有功能的血管内皮和肝细胞. 2002年Schwartz et al[31]报道在体外成功地将MAPCs诱导分化为肝细胞, 将MAPCs接种于以纤维结合素、胶原蛋白、 Matrigel为基质的无血清培养基 (600 mL/L低糖DMEM、400 mL/L MCDB-201)中, 先给予20 mL/L FCS、EGF、LIF和血小板衍生生长因子(PDGF-BB)培养8-12 h后换液, 再加入5-50 ng/mL HGF、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、纤维母细胞生长因子(FGF-4)、FGF-7, 或者制瘤素M、DMSO、丁酸钠等诸多细胞因子、化学药品协同作用下诱导培养, 最后约60%细胞有上皮细胞样表型, 先后表达不同分化时期的肝细胞标志, 还具有成熟肝细胞的功能. 第7 d时表达肝细胞核因子-3 (hepatocyte nuclear factor-3, HNF-3)、锌指转录因子家族成员(a family member of zinc finger transcription factors)-GATA4、细胞角蛋白19(CK19)、甲状腺运载蛋白(transthyretin)、甲胎球蛋白(AFP); 第14-28 d时细胞表达CK18、HNF-4和HNF-1α. MAPCs诱导后, 定量的RT-PCR分析显示诱导后细胞的早期分化标志(HNF-3、GATA4、CK19、AFP)和后期标志(CK18、HNF-4和HNF-1α、细胞色素P450), 都证明了MAPCs向肝细胞分化. 诱导分化的肝细胞, 可以合成和分泌尿素, 具有细胞色素P450的活性, 可以摄取低密度脂蛋白、合成糖原和糖异生等功能. 2002年Jiang et al[32]将MAPCs植入致死剂量射线照射的受体内可重建造血并分化为肝脏上皮组织.
4 ASC横向分化潜能在肝脏疾病治疗中的应用
ASC诱导分化产生肝实质细胞的研究具有广阔的应用前景, 对于我们这样一个病毒性肝炎高发的国家更具有特殊的意义. 对肝硬化、肝坏死疾病的治疗采用生物人工肝辅助治疗或者对病变部位实行细胞替代、对遗传性肝脏疾病采用基因转移治疗是新发展起来并极有前景的肝脏病学治疗战略. ASC诱导分化产生肝实质细胞为肝脏疾病的细胞治疗提供了另一个选择.
适合肝脏疾病细胞治疗的供体细胞应具有以下特点: (1)易于获得、培养、增生, 或建立细胞系; (2)能定向分化为所需的肝细胞或胆管上皮细胞; (3)具有成熟细胞所有的代谢功能, 移植入体内能长期存活; (4)人源性, 表型正常, 不诱发免疫反应, 对宿主无害; (5)如果用于基因治疗, 目的基因可高效转染供体细胞. 对于不易获得同类干细胞来源的组织, 假若能从存在于自身其他部位的成体细胞分化为受损部位的细胞, 是一种十分令人鼓舞的前景. 从患者或供者的骨髓、脐带血或外周血中分离MMSC、HSC、MAPC等干细胞比获取肝干细胞相对要容易得多, 因此具有多向分化潜能的骨髓、脐带血、外周血等来源的干细胞将为肝细胞移植和生物人工肝提供一种新的干细胞来源, 同时借助现有脐带血库、骨髓库等可在肝脏疾病的治疗中发挥更大的作用.
我们也应注意到, 虽然ASC的研究已经取得较大进展, 但在临床上应用还有许多问题: 目前的多数实验结果来自动物体内实验, 而且许多是群体细胞研究, 并未在克隆细胞水平得到证实; 有些ASC是多能干细胞, ASC分化的可塑性, 还需要有更多的论证和深入研究; 人ASC的特性是否与动物一致, 体外结果是否与体内一致还不知道; ASC的分化潜能到底有多大; 干细胞横向分化时微环境中生长因子、细胞周期动力学、细胞黏附和基因表达的改变、启动横向分化的遗传和细胞机制还不十分清楚; ASC的应用研究刚刚起步, 在临床上应用还存在体外分离、扩增、诱导及移植后增生调控等技术问题. 但现代生物技术在ASC相关研究中的应用必将加快其在临床移植修复治疗中的应用进程.
