修回日期: 2003-07-01
接受日期: 2003-07-16
在线出版日期: 2004-01-15
N/A
引文著录: 王春花, 成军, 郎振为, 王建军, 刘妍, 杨倩, 党晓燕. 乙型和丙型肝炎病毒与转录因子ATF-2的调节. 世界华人消化杂志 2004; 12(1): 165-168
Revised: July 1, 2003
Accepted: July 16, 2003
Published online: January 15, 2004
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004; 12(1): 165-168
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v12/i1/165.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v12.i1.165
乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的感染, 不仅引起急、慢性病毒性肝炎, 而且与肝纤维化、肝细胞癌(HCC)的发生密切相关. 虽然HBV和HCV感染与HCC之间的关系已经得到确定, 但是要阐明其具体的分子生物学机制还有许多工作要做. 由于肝炎病毒可以影响细胞信号转导, 引起细胞的病变及恶性转化[1], 而激活转录因子-2 (activating transcription factor-2, ATF-2) 是重要的细胞信号转导途径中的转录因子, 因此深入研究二者的相互关系对肝炎病毒的发病机制会有进一步的了解.
ATF-2是具有碱性－亮氨酸拉链结构的ATF/CREB家族的一种活性转录因子. 碱性-亮氨酸拉链(basic leucine zipper, bZIP) 家族结构的特点是蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基, 结果就导致这些亮氨酸残基都在α螺旋的同一个方向出现. 两个相同结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合成二聚体, 该二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基, 借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合. 若不形成二聚体则对DNA的亲和结合力明显降低. 亮氨酸拉链是最简单的二聚作用界面之一. 他能够介导有高度选择性的, 非常重要的蛋白质结合作用. 他最早是作为C/EBP和 GCN4中的序列模体以及许多转录因子相互作用的界面而被鉴定和认识的.
这些蛋白质可以识别两类DNA元件: AP-1/TRE和ATF/CRE 序列模体. AP-1/TRE元件有保守的TGACTCA, 他是一个拟二元对称. 与这个位点结合的蛋白质包括Fos和Jun家族, 他们可以被促进有丝分裂的、诱导分化的和神经原专一的刺激所诱导. 但是, 来自活性转录因子(ATF)家族, 和来自与cAMP响应元件(CRE) 结合的蛋白质(CREB)家族的转录因子虽然也有亮氨酸拉链, 却不与DNA中的AP-1结合位点相互作用, 而与DNA序列中的ATF/CRE元件结合, 其含有TGACGTCA保守序列, 他是一个二元对称. 与这个位点结合的蛋白质基因的表达与cAMP、钙和病毒所诱导的反应有关. 不仅如此, 这两个家族之间的成员还可以通过亮氨酸拉链相互作用, 形成混合的异源二聚体. 可是, 这些异源二聚体却又有完全不同的DNA结合专一性. 比如, ATF-4与Fos/Jun形成的二聚体优先结合CRE. 这可以解释为什么Fos /Jun也有一定的CRE结合活性. 所以, 由于细胞内各种组分的数量、比例和他们相互作用形成的异源二聚体等的差别, 就可以在细胞核内造成非常复杂的基因表达调节格局, 并在各种信号转导通路之间形成自由对话的局面.
ATF是一种参与许多腺病毒E1A和cAMP诱导的启动子转录调节的细胞转录因子, 这是一类与DNA结合特异性和免疫交叉反应性相关的蛋白质家族[2]. Horikoshi et al[3]发现ATF能通过结合到大量上游启动子和增强子元件而促进腺病毒E4启动子的转录. DNA酶印迹分析表明当ATF和TFIID(哺乳动物TATA相关因子)同时结合到启动子上时能发生协同作用, 而促进RNA聚合酶Ⅱ和普通转录起始因子TFIIB和TFIIE对启动子的识别. 并且即使ATF从该完整的前起始复合物上解离后, TFIID和其他的普通转录因子的复合物也是稳定的.该实验表明ATF是TFIID的直接靶目标, 这种相互作用有利于完整的转录前起始复合物的组装, 并且ATF的作用是瞬时的.
ATF/CREB都可以结合到CRE元件上, 区别在于磷酸化激活机制不同. CREB在将细胞外刺激所诱发的细胞内信号传入细胞核的过程中起着重要的作用. 细胞外的信号(配体) 与细胞表面的信号接受装置-受体相互作用, 激活了AMP环化酶, 使细胞内cAMP的量大为增加. cAMP与蛋白激酶A(PKA) 的调节亚基结合, PKA的催化亚基则将向细胞核移行的CREB蛋白磷酸化. 这时, CREB的第133位丝氨酸残基被磷酸化, CREB也因而活化, 并促使他的靶基因表达[4-7]. 而ATF则还需要其他的胞质蛋白激酶的磷酸化作用.
早在1988年Lin et al[8]认为ATF在体内可被两种明显不相关的诱导物所诱导: 腺病毒E1a蛋白和cAMP. ATF可作为E1a和cAMP信号传导通路中的一个环节而参与许多E1a和cAMP诱导的启动子的转录表达. 而后1990年Liu et al[9]进一步研究了E1a的作用机制, 发现E1a蛋白包含转录激活域当结合到启动子上时就能发挥作用, 但是E1a不是一种序列特异性DNA结合蛋白, 许多病毒早期启动子都有一个或更多个ATF家族的结合位点, E1a就是通过与特异性ATF蛋白即ATF-2作用而将其激活域定位于病毒启动子上进而调节基因的表达.
ATF-2分子量为54.5 kD, 作为ATF/CREB家族中的一员, 同样具有碱性-亮氨酸拉链结构, 以同型二聚体或异源二聚体的形式结合到CRE元件上[10], 所以又称为CRE结合蛋白-1(CRE-binding protein-1, CRE-BP1), 在埃希氏大肠杆菌中表达的CRE-BP1不仅可以结合到生长抑素和纤维连接蛋白基因的CRE 元件上, 还可以结合到腺病毒E4基因的CRE元件上, 这也暗示着CRE-BP1与腺病毒的转录因子ATF是不可区分的[11]. ATF-2在细胞广泛表达但在脑组织中含量最高[12].
ATF-2包含两个功能结构域, 氨基端反式激活域和羧基端DNA结合域. DNA结合域中具有碱性亮氨酸拉链基序; 反式激活域又分为两个亚区: 氨基端亚区具有与通常存在于DNA结合域中知名的锌指基序相似的结构, 包含一个反平行的-片层和一个-螺旋. 锌原子四周并列着两个半胱氨酸和两个组氨酸残基[13]. 羧基端亚区呈现高度灵活的无序结构, 包含两个能被SAPK(stress-activated protein kinases) 磷酸化的苏氨酸位点, 当ATF-2特异性结合到靶蛋白上时, 其可能会发生构象的改变.
Livingstone et al[14]在Liu et al[9]实验的基础上设计了蛋白缺失实验发现ATF-2的氨基端对于ATF-2与E1a之间的相互作用是必不可少的; 并且在缺少E1a的情况下, 当与异源DNA结合域融合后, ATF-2的氨基端仍能激活转录. 在完整蛋白中此激活结合域被遮盖了. 激活所必需的氨基端残基对于介导E1a的刺激也是必需的, 特别是69和71位的两个苏氨酸残基必不可少, 这些残基在体内、外都可被MAPK家族的JNK/SAPK 亚家族有效地磷酸化. ATF-2可通过氨基端不同磷酸化位点的结构域结合到UV诱导激酶, 这个结合域对于体外JNK/SAPK 的磷酸化和体内的转录激活都是必需的. UV的辐射激活了JNK/SAPK 信号传导通路, 进而促进了氨基端的活性. 由此推测尽管ATF-2能结合到E1a蛋白上, 但氨基端的激活域对于这种结合是不起作用的, E1a本身具有激活域, 其与ATF-2的结合只是借助其DNA结合域定位于启动子上而发挥其激活作用. ATF-2与DNA结合蛋白ATF/CREB 家族的其他成员一样, 其激活域是通过特定的信号传导途径来调节的.
关于ATF-2参与的特殊的信号传导途径已有陆续的报道. Shuman et al[15]研究报道ATF可在肝组织中表达并且其特定碱基被MAPK/P38, MAPK/JNK磷酸化后表现出明显增加的DNA结合和转录活性. Sano et al[16]也报道ATF-2是转化生长因子(TGF)介导的两条信号传导途径的共同靶位; 经典的TGF-Smad途径中, Smad3 和Smad4形成异源二聚体, 此复合物经由Smad蛋白的MH1结构域与ATF-2的亮氨酸拉链区域相结合并激活ATF-2的转录活性. 此外还发现TGF通过激活TGF激活激酶-1(TAK-1)(此为MAPKKK家族中的一员)激活MAPK/P38而间接磷酸化ATF-2.认为在TGF介导的Smad和Tak-1两条信号传导途径中ATF-2作为一种共同的靶目标而发挥重要作用.
MAPK家族是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族, 其通过磷酸化ATF-2的特定碱基而激活其转录活性, 作用于靶基因, 引起转录响应. 但ATF-2在MAPK信号调节和细胞增生过程中的作用知之较少, Crowe et al[17]在此方面作了深入研究, ATF-2在人类肝癌细胞系中过量表达, 能抑制细胞周期中G1/S期的转换, 降低细胞的增生速率; 减弱的增生与细胞周期有关, 并且不依赖于MAPK/ERK1的表达抑制. 遗传学和药理学均表明ERK1活性抑制足以修复ATF-2在细胞周期进程和细胞增生中的作用. 该研究发现在肝癌细胞增生中ATF-2具有新的功能, 并且暗示存在一种可能的反馈机制调节MAPK信号传导途径.
Woo et al[18]认为ATF-2不仅参与了大量的细胞内信号传导途径, 还猜测作为一种抑癌蛋白发挥作用. 他们发现ATF-2基因存在于人类2q32染色体上, 此区域也是人类肺癌LOH共同的定位区域. 在成神经细胞瘤和肺癌中, 在2q染色体上可以检测到LOH表现出高发生率; 并且ATF-2基因变异的杂合鼠中肺癌的发生率较高. 受此启发猜测ATF-2基因可能作为一种候选的2q染色体上抑癌基因而在人类致癌机制中发挥作用. 经深入研究发现ATF-2基因不是2q染色体上主要的抑癌基因, 但可能ATF-2突变参与了一小亚类肺癌的发生.
乙型肝炎病毒的慢性感染是引发肝细胞癌的主要危险因子, HBV诱导细胞恶性化的发病机制还未完全弄清. HBV基因组的X 开放读码框(ORF)编码一条145-154个氨基酸残基的蛋白, 分子量17 kD左右. 乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg) 对于土拨鼠的嗜肝病毒感染和其他哺乳动物嗜肝DNA病毒在体内复制是必不可少的. HBxAg对多种增强子及启动子有反式激活作用.
自从1987年Spandua et al[19]报告了HBxAg的表达能反式激活劳氏肉瘤病毒(RSV)和SV40中的氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因以来, 很多实验室很快证实了HBxAg对多种同源或异源病毒或细胞的基因转录调节区有反式激活作用, 如HBV增强子/核心启动子、S基因启动子, SV40的增强子及早期启动子, 单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-TK)启动子; 人T淋巴细胞I型病毒(HTLV-1)的长末端重复序列(LTR)、人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)、RSV及-干扰素等的启动子. HBxAg也可反式激活聚合酶(pol)I、II、III启动子[20,21], 很多顺式作用元件也随之被报道与X蛋白有相互作用, 被定义为X 应答元件(XRE), 包括AP-1、AP-2、c/E NF-B、SRF、BP、Ets、ATF1及CREB. HBxAg可以作为转录的反式激活因子, 也可以与其他反式激活因子相互作用而起作用[22-24]. bZip家族、Egr1的反式激活因子都被报道与HBxAg有结合作用.
HBxAg虽然没有对基本转录起作用, 但他能激活转录; 但其对启动子的选择机制不清楚, pX不能独立结合到核酸分子上, HBxAg可能需要一系列的转录激活因子才能发挥其协同转录激活因子的作用. Haviv et al[25]提出一种可能的解释, HBxAg一旦加入转录作用, 就可与一些反式激活因子如bZip家族相互作用.
Williams et al[26]证实了这种猜测, 通过设计体外重组蛋白和DNA结合试验探讨了CREB/ATF与pX蛋白-蛋白相互作用的机制, 报道发现pX能与CREB/ATF家族的碱性亮氨酸拉链区域相结合, 而非酵母反式激活蛋白Gal4的DNA结合域, 虽然这种结合不能改变CRES/ATF形成二聚体的速率, 但能增加CREB/ATF与CRE元件的亲和性, 在pX转染PC12细胞系时, 受叉头蛋白刺激后生长抑素启动子的转录活性增加15倍, 这个结果有力支持了X-CREB/ATF蛋白-蛋白相互作用具有重要意义的观点.
进一步的研究 [27] 发现 pX不但能增加ATF的亲和性还能与细胞内转录因子CREB和ATF-2形成蛋白-蛋白复合物并能改变他们的DNA结合特异性. 尽管单独的CREB和ATF-2不能结合到HBV增强子上, 但pX-CREB或pX-ATF-2复合物却能结合到HBV增强子元件上. 因此, pX通过与细胞因子相互作用而扩宽了这些调节蛋白的DNA结合的特异性, 并且为pX提供了一条能参与转录调节的机制, 该结论提供了一种在病毒感染时被转录因子调控了的基因修复策略, 即可通过改变其DNA结合的特异性来实现.
pX与ATF-2[28]相互作用是pX在体内许多重要反式作用机制的重要途径之一. 例如, 磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPCK) 基因就受到pX经由两个不同的启动子区域而调节其转录水平, 其中之一就是通过pX与C/EBP α和ATF-2相互作用形成复合物而作用于近端启动子的cAMP反应元件位点(CRE-1), 从而介导了PEPCK基因的反式激活.
丙型肝炎病毒基因组含有单一的开放读码框架, 编码3 010-3 033个氨基酸残基的多肽前体, 两侧是5'-非翻译区及3'-非翻译区.多肽前体至少被加工为十种结构蛋白和非结构蛋白, 其中核心区(1-573 nt)编码的21 kD HCV核衣壳蛋白(191 aa)是一种多功能蛋白质, 在HCV致病过程中可能起着重要的作用[29-30], 最近研究发现其与HCV感染后脂肪肝的形成有一定关系[31-33].
HCV核衣壳蛋白可以与许多病毒和细胞内的蛋白和启动子相互作用, 其与ATF-2作用机制也有相关报道. Erhardt et al[34]利用四环素调节系统创建了HepG2 Tet-off细胞系来研究全长的(191 aa)和氨基端截短型 (160 aa) 核衣壳蛋白的表达调节. 在该系统中HCV核心蛋白的表达激活MAPK家族的3个亚族ERK, JNK和p38激酶, 诱导MAP激酶磷酸酶(MKP-1)的表达, 促进了细胞的增生. 此过程伴随着c-Jun和ATF-2的激活, 而不是E1k-1和c-Fos. 并且全长型和氨基端截短型核衣壳蛋白作用类似.
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