胃癌 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-09-15; 11(9): 1314-1317
在线出版日期: 2003-09-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i9.1314
毒物代谢酶基因多态与胃癌的关联
叶梅, 刘君炎, 邓长生
叶梅, 邓长生, 武汉大学中南医院消化内科 湖北省武汉市 430071
叶梅, 女, 1970-12-16生, 重庆市人, 汉族, 2001年武汉大学医学院硕士, 现武汉大学中南医院消化内科博士生, 主要从事消化道肿瘤和炎症性肠病的研究.
刘君炎, 武汉大学医学院免疫学教研室 湖北省武汉市 430071
基金项目: 湖北省卫生科技基金资助课题, No. WJ01572
通讯作者: 邓长生, 430071, 湖北省武汉市东湖路169号, 武汉大学中南医院消化内科. yemei1970@hotmail.com
电话: 027-67813247 传真: 027-87330532
收稿日期: 2003-04-03
修回日期: 2003-04-20
接受日期: 2003-05-16
在线出版日期: 2003-09-15

目的

探讨CYP2E1 PstI多态与GSTT1空白基因型与胃腺癌的关联.

方法

胃腺癌患者56例及健康人对照56名, 分别采用PCR-RFLP技术与多重PCR方法, 检测CYP2E1基因型和GSTT1空白基因型.

结果

CYP2E1 C1/C1基因型在胃癌组和健康人对照组中的分布频率分别是69.6 %和46.4％, 差异具有显著性(x2=6.27;P <0.05); GSTT1空白基因型在胃癌和健康人中的分布频率分别为60.7 %和46.4 %, 在胃癌中分布频率较高, 但未有统计学意义(x2 =2.30; 0.1<P<0.25); CYP2E1基因与GSTT1基因联合分析, 结果显示GSTT1空白基因型/CYP2E1(C1/C1)基因联合型在胃癌中的分布频率显著高于其他基因联合型, 差异具有统计学意义(x2=3.98; 0.025<P <0.05).

结论

CYP2E1 C1/C1基因型与胃癌遗传易感性相关; GSTT1空白基因型不增加胃癌的危险性; 基因之间具有联合作用, GSTT1非空白基因型/CYP2E1(C1/C2或C2/C2)基因联合是胃癌的保护因素, GSTT1空白基因型/CYP2E1(C1/C1)基因联合是胃癌的危险因素, 即同时具有GSTT1空白基因型及CYP2E1 C1/C1基因型的个体罹患胃癌的危险性显著增加.

关键词: N/A
引文著录: 叶梅, 刘君炎, 邓长生. 毒物代谢酶基因多态与胃癌的关联. 世界华人消化杂志 2003; 11(9): 1314-1317
Relationship between xenobiotic-metabolizing enzyme gene polymorphisms and genetic susceptibility of gastric cancer
Mei Ye, Jun-Yan Liu, Chang-Sheng Deng
Mei Ye, Jun-Yan Liu, Chang-Sheng Deng, Department of Gastroenterology, Zhongnan Hostipal, Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei Province, China
Supported by the Health Science and Technology Fund of Hubei Province, No. WJ01572
Correspondence to: Dr. Chang-Sheng Deng, Department of Gastroenterology, Zhongnan Hostipal,Wuhan University,Wuhan 430071, Hubei Province,China. yemei1970@hotmail.com
Received: April 3, 2003
Revised: April 20, 2003
Accepted: May 16, 2003
Published online: September 15, 2003

AIM

To investigate the relationship between genetic polymorphisms of CYP4502E1 and GSTT1 and gastric cancer.

METHODS

Fifty six patients with histologically confirmed gastric adenocarcinoma (GC case group) and 56 healthy persons (control group), matched by age, sex, smoking, dietary habits and family history of cancer were studied. Genomic DNA samples were assayed for restriction fragment length polymorphisms in the CYP2E1 by PCR amplification followed by digestion with endonuclease PstI, and GSTT1 genes were detected by multiplex PCR.

RESULTS

The frequency of CYP2E1 C1/ C1 genotype was 69.6 % in GC group and 46.4 % in control group, with a statistically significant difference (x2=6.27; P <0.05, OR=1.915, 95 % CI=1.051-3.489). The frequency of GSTT1 null genotype was higher in GC group (60.7%) than in control group (46.4 %), but the difference was not statistically significant (x2=2.30; 0.1<P<0.25,P =1.783,95 % CI=0.842-3.777). Furthermore, a joint effect of the CYP2E1 and GSTT1 genotypes on cancer risk was observed. GSTT1 non-null genotype/C1/C2 or C2/C2 genotype was lower than that in GC group (x2=6.23; 0.01<P<0.025, P =0.302,95 % CI=0.114-0.796). The GSTT1 null genotype/C1/C1 genotype in GC group was significantly higher than that in the other groups (x2=3.98; P <0.05, P =2.250, 95 % CI=1.007-5.026).

CONCLUSION

CYP2E1 C1/C1 genotype is associated with gastric cancer and individuals who carrry the C1 allele have a higher risk of developing GC than those with the C1/C2 or C2/C2 genotype. GSTT1 null genotype does not increase the risk of GC. Combined analysis of polymorphisms has shown that GSTT1 non-null genotype/C1/C2 or C2/C2 genotype is protective factor of GC and GSTT1 null genotype/C1/C1 genotype is a risk factor of GC. That is, individuals with both GSTT1 null genotype and CYP2E1 C1/C1 genotype have a greater risk of GC.

Key Words: N/A
0 引言

近年来, 环境因素在胃癌病因中的作用受到重视, 尤其是亚硝胺与胃癌的发病有关. 但个体对肿瘤的易感性因人而异, 其中毒物代谢酶的遗传多态现象是研究肿瘤遗传易感性的重要方面. 细胞色素P450家族(cytochrome P450, CYP)和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S- transferase, GST)是体内重要的I相酶和II相酶. 毒物代谢酶受遗传控制, 具有广泛多态性, 基因多态影响蛋白表达, 引起酶的活性改变. 对外界致癌物的代谢能力改变, 在一定程度上决定了机体患肿瘤危险性的差异[1]. 但在研究CYP2E1及GSTT1基因多态与肿瘤的关联时, 结论并非一致. 我们采用分子生物学技术, 检测胃腺癌患者CYP2E1 PstI多态及GSTT1空白基因型的分布频率, 探讨CYP2E1 Pst I多态及GSTT1空白基因型与胃腺癌的关系.

1 材料和方法
1.1 材料

武汉大学中南医院及湖北省肿瘤医院业经胃镜活检和(或)手术标本病理诊断为胃腺癌患者56例, 男42例, 女14例, 年龄22-79 (平均57.6岁). 对照组56名, 为同期在武汉大学中南医院体检的无血缘关系的健康人56名, 男39名, 女17名, 年龄26-86 (平均58.0岁), 其性别、年龄等因素与胃癌组配比相似. 研究对象均为湖北地区汉族人, 收集研究对象的职业、籍贯、饮食习惯、吸烟、饮酒及家族史等. 三磷酸脱氧核糖核苷酸(dATP, dCTP, dGTP, dTTP四种)、Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液和MgCl2均为Promega生物有限公司产品; 限制性内切酶Pst I及相应的缓冲液和DNA分子质量Markers为华美生物工程公司产品; 参照GeneBank的DNA序列分别设计CYP2E1, GSTT1和b-globin(作内参照)基因扩增引物, 均由加拿大上海生工生物工程公司合成(PAGE纯化). PCR扩增仪为珠海 HeMa-240型.

1.2 方法

研究对象均于清晨空腹取静脉血1 mL (分作2份, 1份备用), EDTA種a2抗凝, 胃腺癌患者于放化疗前采血. 碘化钠法提取DNA, 加TE缓冲液溶解DNA后用20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定, -20 °C保存备用.

CYP2E1基因分型 其引物序列为5'-CCA GTC GAGTCT ACA TTG TCA-3'和5'-TTC ATT CTG TCT TCT AAC TGG-3'. PCR反应体系总体积为50 mL, 内含DNA模板2 mL (0.1-0.5 mg), 15 mmol/L MgCl2 5 mL, 50 mmol/L引物1 mL, 2 mmol/L dNTP 5 mL和相应的缓冲液. 用优质石蜡油30 mL封盖, 95 °C预变性8 min后加入Taq DNA 酶2 mL, 按94 °C 45 s、55 °C 45 s、72 °C 60 s运行35个循环, 72 °C延伸8 min. 用80 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物, 其扩增片段为410 bp. 取PCR扩增产物10 mL, 用限制性内切酶Pst I 37 °C恒温水浴箱内消化18 h, 65 °C 15 min终止反应. 取酶切产物用80 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳, 分析其基因型.

GSTT1基因检测 其引物序列为GSTT1-1: 5'-TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC-3'GSTT1-2: 5'-TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA-3', b-globin B1: 5 '-CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC-3', b-globinB2: 5'-GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC-3'. PCR反应总体积为50 mL, 内含模板4 mL, 10×Buff 缓冲液5 mL, 25 mmol/L MgCl2 3 mL, 2 mmol/L dNTP 5 mL, TaqDNA酶2.5 mL, GSTT1-1, GSTT1-2, b-globin B1和b-globin B2 各2 mL, 加双蒸水至总体积50 mL, 用石蜡油30 mL封盖, 97 °C预变性8min, 按95 °C 45 s, 57 °C 45 s, 72 °C 60 s, 30个循环, 72 °C延伸8 min. PCR产物用50 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳分析其基因型.

统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件进行x2检验, 以P <0.05确定为有统计学意义.

2 结果

从胃癌患者和健康人对照组的外周血提取DNA为模板, 采用PCR-RFLP技术及多重PCR方法进行CYP2E1, GSTT1基因分型. CYP2E1基因的DNA样品, 经PCR扩增后, DNA产物为410 bp一条带(图1), 经PstI酶切后产生了3种不同的基因型: 纯合子野生型(C1/C1), 纯合子突变型(C2/C2)及杂合子(C1/C2)(图2); GSTT1非空白基因型的DNA样品, 经多重PCR扩增后(b-globin为内参照), DNA产物为268 bp和480 bp两条带, GSTT1空白基因型则只有268 bp一条带(为b-globin扩增产物)(图3). 因此, 非空白基因型包括有2个基因拷贝的纯合子和仅有一个基因拷贝的杂合子, 而空白基因型则为纯合子基因缺乏.

图1
图1 CYP2E1基因PCR扩增产物的PAGE图谱. 1-5: 研究对象(胃癌和对照者)的PCR扩增产物; 6: DNA marker pBR322DNA/MspI.
图2
图2 CYP2E1基因PCR-RFLP酶切后(Pst I), PAGE图谱. 1: DNA marker pBR322DNA/Msp1; 2: C1/C2基因型; 3, 5: C1/C1基因型; 4: C2/C2基因型.
图3
图3 GSTT1基因, b-globin基因PCR扩增产物的PAGE图谱. 1: pBR322/Hae III DNA分子marker; 2, 5, 6:GSTT1非空白基因型; 3, 4, 7, 8:GSTT1空白基因型.
2.1 CYP2E1基因型的分布

在胃癌患者、健康人中, CYP2E1基因型C1/C1, C1/C2, C2/C2分别为69.6 %, 23.2 %, 7.1 %和46.4 %, 42.9 %, 10.7 %. 两组相比, x2=6.27, P =0.043, OR=1.915, 95 % CI=1.051-3.489. C1/C1基因型在健康人对照组及胃癌组的分布频率高于C1/C2及C2/C2基因型个体, 二者差异有显著性.

2.2 GSTT1空白基因型的分布

在胃癌、健康人中, GSTT1空白基因型为60.7 %和46.4 %; GSTT1非空白基因型为39.3 %和53.6 %. GSTT1空白基因型在胃癌中的分布频率较高, 但尚未有统计学意义(x2=2.30, P =0.130, P =1.783, 95 % CI=0.842-3.777), 提示GSTT1空白基因型并不增加胃癌的危险性, 即GSTT1空白基因型与胃癌易感性无关.

2.3 CYP2E1, GSTT1基因联合型与胃癌易感性

基因之间可能存在联合作用. 鉴此, 我们进一步分析CYP2E1与GSTT1各种基因联合与胃癌的关系. 结果表明, 在胃癌组, GSTT1非空白基因/CYP2E1 (C1/C2或C2/C2)基因型频率为12.5 % (7/56), GSTT1空白基因/CYP2E1(C1/C2或C2/C2)基因型频率为17.9 % (10/56), GSTT1非空白基因/CYP2E1(C1/C1)基因型频率为26.8 % (15/56), GSTT1空白基因/CYP2E1(C1/C1)基因型频率为42.8 % (24/56). 在健康人分别为32.1 % (18/56), 21.4 % (12/56), 21.4 % (12/56), 25.0 % (14/56). 将每一种基因联合型分别视为暴露因素, 与其他基因联合型进行对照分析, 结果显示GSTT1非空白基因/CYP2E1(C1/C2或C2/C2)基因联合型在胃癌中的分布频率显著低于其他基因联合型, 说明发生胃癌的危险性显著降低(x2=6.23, 0.01<P <0.025), GSTT1空白基因/CYP2E1(C1/C2或C2/C2)和GSTT1非空白基因/CYP2E1(C1/C1)基因联合型在胃癌分布与健康人相比差异无显著性(x2=0.23, 0.5<P <0.75), 而GSTT1空白基因/CYP2E1(C1/C1)基因联合型在胃癌中的分布频率显著高于其他基因联合型, 差异具有统计学意义(x2=3.98, 0.025<P <0.05). 即GSTT1空白基因/CYP2E1(C1/C1)基因联合型个体发生胃癌的危险性, 是其他基因联合型个体的2.25倍, 提示GSTT1非空白基因/CYP2E1(C1/C2或C2/C2)基因联合型是胃癌的保护因素, 而GSTT1空白基因/CYP2E1(C1/C1)基因联合则是胃癌的危险因素, 分析单基因在基因联合中的作用, CYP2E1基因型可能更重要.

3 讨论

肿瘤的发生是多病因多步骤的过程. 多数人类肿瘤来源于复杂的突变事件, 是个体内在因素和环境中的致癌剂共同作用的结果. 与胃癌相关的外界致癌物主要是亚硝胺类致癌物. 动物实验表明, 亚硝胺可诱导实验动物发生口腔、食管、鼻咽、前胃、肝脏、肺等的肿瘤. CYP2E1 PstI基因多态与GSTT1空白基因型影响酶的表达及活性, 对亚硝胺类外界致癌物、致突变物代谢能力下降, 机体对肿瘤易感性增加. 本结果提示, CYP2E1C1/C1基因型在胃腺癌中的分布频率显著高于C1/C2及C2/C2 基因型, C1/C1基因型个体患胃腺癌的危险性比至少携带一个C2等位基因的个体增加2.65倍. 一些学者研究发现C1/C1基因型与食管癌[2]、肺癌[3]危险性相关. Le Marchand et al [4]研究CYP2E1基因型与表型的关系时, 发现CYP2E1 C2/C2基因型个体的CYP2E1酶活性较C1/C1型或C1/C2型个体显著降低, 进一步说明CYP2E1 C1/C1基因型是肿瘤易感基因. 但也有持异议者. Wu et al [5]发现台湾胃癌患者中C2/C2基因型的分布频率较健康人对照有显著差异. Nishimoto et al [6]研究日裔巴西人胃癌患者时, 显示C1基因可降低胃癌危险, 在弥散型胃癌中, C2等位基因分布更普遍. Kiss et al [7]研究认为CYP2E1C2/C2基因型与结肠癌危险性相关. 也有报道认为CYP2E1基因型与器官特异性肿瘤如肝癌[8]、胃癌[9]、肠癌[10]、肺癌[11]等无关.

GSTT1空白基因型与肿瘤之间的关系尚有争议. 德国学者Bruhn et al [12]研究GSTT1基因型与表型的关系, 认为GSTT1酶活性最高的为纯合子野生型, 中等的为杂合子, 活性最低的则为GSTT1空白基因型. 芬兰报道, 单独的GSTM1、GSTT1基因多态与肺癌无关, 而GSTM1/GSTT1空白基因联合时, 则增加鳞状细胞癌危险性[13], 是其他基因联合型的2倍, 且肺癌与中等度吸烟(小于15支/d)相关, 与重度吸烟(大于15支/d)无关联. 另外, 文献还报道GSTT1空白基因型增加了大肠癌、膀胱癌的危险性[14,15]. 台湾学者Sun et al [16]报道GSTT1空白基因型的慢性乙肝病毒表面抗原携带者, 黄曲霉素作为暴露因素, 发展为肝细胞癌的危险性较GSTT1非空白基因型的对照组显著增加. GSTT1与胃癌的关联尚有争议. Setiawan et al [17]研究中国143例胃癌患者, 166例慢性胃炎及433例对照人群, 发现GSTT1空白基因型与胃癌危险性相关(OR=2.5, 95 % CI=1.01-6.22), 与慢性胃炎无关. 但Saadat et al [18]研究则认为GSTT1基因型并不增加胃癌和肠癌的危险性, 但同时携带GSTT1和GSTM1空白基因型则增加了患胃肠癌风险. 本研究中胃癌组、健康人组在吸烟、饮食习惯、家族史等因素无显著差异, GSTT1空白基因在胃癌和健康人中的分布频率分别为60.7 %和46.4 %, 差异无统计学意义, 故尚无依据认为GSTT1空白基因型为胃癌的易感基因.

外界致癌物在体内的代谢依赖I相酶和II相酶的共同作用, 在研究代谢酶与肿瘤的关系时, 有必要进行基因联合分析. 本结果显示, GSTT1空白基因型/CYP2E1 C1/C1型的个体患胃癌的危险性显著增加, 是其他基因联合型的2.25倍. GSTT1非空白基因型/CYP2E1 (C1/C2及C2/C2)型的个体患胃癌的风险较其他基因型个体显著降低, 差异有显著性, 提示同时具有CYP2E1 C1/C1基因及GSTT1空白基因型个体为胃癌高危人群. 外界致癌物进入体内后, 被具有较高活性的I相酶CYP2E1活化达到最大致癌效应, 而GSTT1空白基因型不能有效地表达GSTT1, 酶活性下降或缺乏, 不能将I相酶代谢活化后形成的亲电子复合物即前致癌物降解排出体外, 导致合成DNA加成物, 染色体畸变, 形成肿瘤. 单独的GSTT1空白基因型并不增加患癌危险, 提示基因联合作用有时在肿瘤的发生过程中更重要.

1.  Hirvonen A. Polymorphisms of xenobiotic-metabolizing enzymes and susceptibility to cancer. Environ Health Perspect. 1999;107:37-47.  [PubMed]  [DOI]
2.  Tan W, Song N, Wang GQ, Liu Q, Tang HJ, Kadlubar FF, Lin DX. Impact of genetic polymorphisms in cytochrome P450 2E1 and glutathione S-transferases M1, T1, and P1 on susceptibility to esophageal cancer among high-risk individuals in China. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2000;9:551-556.  [PubMed]  [DOI]
3.  Li ZS, Tan W, Shao K, Zhang L, Lin DX. Susceptibility to lung cancer in Chinese is associate with genetic polymorphism in cytochrome P4502E1. Zhonghua Zhongliu Zazhi. 2000;22:5-7.  [PubMed]  [DOI]
4.  Le Marchand L, Wilkinson GR, Wilkens LR. Genetic and dietary predictors of CYP2E1 activity: a phenotyping study in Hawaii Japanese using chlorzoxazone. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1999;8:495-500.  [PubMed]  [DOI]
5.  Wu MS, Chen CJ, Lin MT, Wang HP, Shun CT, Sheu JC, Lin JT. Genetic polymorphisms of cytochrome P450 2E1, glutathione S-transferase M1 and T1, and susceptibility to gastric carcinoma in Taiwan. Int J Colorectal Dis. 2002;17:338-343.  [PubMed]  [DOI]
6.  Nishimoto IN, Hanaoka T, Sugimura H, Nagura K, Ihara M, Li XJ, Arai T, Hamada GS, Kowalski LP, Tsugane S. Cytochrome P450 2E1 polymorphism in gastric cancer in Brazil: case-control studies of Japanese Brazilians and non-Japanese Brazilians. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2000;9:675-680.  [PubMed]  [DOI]
7.  Kiss I, Sandor J, Pajkos G, Bogner B, Hegedus G, Ember I. Colorectal cancer risk in relation to genetic polymorphism of cytochrome P450 1A1, 2E1, and glutathione-S-transferase M1 enzymes. Anticancer Res. 2000;20:519-522.  [PubMed]  [DOI]
8.  Wong NA, Rae F, Simpson KJ, Murray GD, Harrison DJ. Genetic polymorphisms of cytochrome p4502E1 and susceptibility to alcoholic liver disease and hepatocellular carcinoma in a white population: a study and literature review, including meta-analysis. Mol Pathol. 2000;53:88-93.  [PubMed]  [DOI]
9.  Tsukino H, Kuroda Y, Qiu D, Nakao H, Imai H, Katoh T. Effects of cytochrome P450 (CYP) 2A6 gene deletion and CYP2E1 genotypes on gastric adenocarcinoma. Int J Cancer. 2002;100:425-428.  [PubMed]  [DOI]
10.  Butler WJ, Ryan P, Roberts-Thomson IC. Metabolic genotypes and risk for colorectal cancer. J Gastroenterol Hepatol. 2001;16:631-635.  [PubMed]  [DOI]
11.  Quinones L, Lucas D, Godoy J, Caceres D, Berthou F, Varela N, Lee K, Acevedo C, Martinez L, Aguilera AM. CYP1A1, CYP2E1 and GSTM1 genetic polymorphisms. The effect of single and combined genotypes on lung cancer susceptibility in Chilean people. Cancer Lett. 2001;174:35-44.  [PubMed]  [DOI]
12.  Bruhn C, Brockmoller J, Kerb R, Roots I, Borchert HH. Concordance between enzyme activity and genotype of glutathione S-transferase theta (GSTT1). Biochem Pharmacol. 1998;56:1189-1193.  [PubMed]  [DOI]
13.  Saarikoski ST, Voho A, Reinikainen M, Anttila S, Karjalainen A, Malaveille C, Vainio H, Husgafvel-Pursiainen K, Hirvonen A. Combined effect of polymorphic GST genes on individual susceptibility to lung cancer. Int J Cancer. 1998;77:516-521.  [PubMed]  [DOI]
14.  Laso N, Lafuente MJ, Mas S, Trias M, Ascaso C, Molina R, Ballesta A, Rodriguez F, Lafuente A. Glutathione S-transferase (GSTM1 and GSTT1)-dependent risk for colorectal cancer. Anticancer Res. 2002;22:3399-3403.  [PubMed]  [DOI]
15.  Salagovic J, Kalina I, Habalova V, Hrivnak M, Valansky L, Biros E. The role of human glutathione S-transferases M1 and T1 in individual susceptibility to bladder cancer. Physiol Res. 1999;48:465-471.  [PubMed]  [DOI]
16.  Sun CA, Wang LY, Chen CJ, Lu SN, You SL, Wang LW, Wang Q, Wu DM, Santella RM. Genetic polymorphisms of glutathione S-transferases M1 and T1 associated with susceptibility to aflatoxin-related hepatocarcinogenesis among chronic hepatitis B carriers: a nested case-control study in Taiwan. Carcinogenesis. 2001;22:1289-1294.  [PubMed]  [DOI]
17.  Setiawan VW, Zhang ZF, Yu GP, Li YL, Lu ML, Tsai CJ, Cordova D, Wang MR, Guo CH, Yu SZ. GSTT1 and GSTM1 null genotypes and the risk of gastric cancer: a case朿ontrol study in a Chinese population. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2000;9:73-80.  [PubMed]  [DOI]
18.  Saadat I, Saadat M. Glutathione S-transferase M1 and T1 null genotypes and the risk of gastric and colorectal cancers. Cancer Lett. 2001;169:21-26.  [PubMed]  [DOI]