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世界华人消化杂志. 2003-08-15; 11(8): 1264-1266
在线出版日期: 2003-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i8.1264
RNA干扰与抗肝炎病毒治疗前景的研究
成军, 刘妍, 王琳, 钟彦伟, 王刚
成军, 刘妍, 王琳, 钟彦伟, 王刚, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. C39970674, No. C03011402.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-03-08
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15

N/A

关键词: N/A
引文著录: 成军, 刘妍, 王琳, 钟彦伟, 王刚. RNA干扰与抗肝炎病毒治疗前景的研究. 世界华人消化杂志 2003; 11(8): 1264-1266
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: March 8, 2003
Revised: March 20, 2003
Accepted: April 16, 2003
Published online: August 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

从基因的分子生物学角度, 病毒性肝炎也是一种基因病, 相对于正常肝细胞来说, 从肝炎患者的肝细胞中获得了肝炎病毒的基因, 因此, 病毒性肝炎的治疗也可以采取象遗传病那样的基因治疗(gene therapy)策略[1-5]. 与遗传病的基因治疗策略不同, 遗传病往往是因为某一或某些基因发生缺陷, 利用基因治疗技术进行补充或者校正; 而病毒性肝炎的基因治疗, 往往是需要采取另外的策略, 即阻断有害的病毒的基因表达的策略. 因为病毒性肝炎的发病机制, 主要是进入肝细胞的肝炎病毒基因编码产生相应的肝炎病毒蛋白, 作为靶抗原激活机体的免疫应答机制, 这种原本是要清除肝细胞中肝炎病毒的正常的免疫应答机制, 却造成了持续的肝细胞的免疫损伤, 引起各种类型的肝脏疾病. 特别是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的慢性病毒性肝炎, 迁延不愈, 释放的各种炎症因子导致肝脏内贮脂细胞(stellate cell)的激活、转化、增生, 分泌过量的细胞外基质(ECM), 并引起肝脏纤维化的形成, 某些情况下通过复杂的生物学机制导致肝细胞的恶性转化, 引起肝细胞癌(HCC)的发生[6-10]. 因此, 从肝炎病毒引起的一系列肝脏疾病谱来看, 主要的源头就是肝细胞中肝炎病毒基因的存在, 因此采用基因治疗技术阻断肝炎病毒基因在肝细胞中的复制和表达, 是我们应该考虑的主要治疗靶点[11-16].

关于阻断肝细胞内肝炎病毒基因复制和表达的策略, 已经进行了许多的基因治疗实验研究的尝试, 如反义寡聚脱氧核糖核苷酸(ODN)、反义RNA、核酶(ribozyme)等曾经是人们关注的焦点, 以人源化单链可变区抗体(scFv)为目的基因的细胞内免疫(intracellular immunization)基因治疗技术也是非常具有吸引力的策略. 最近研究表明, RNA干扰(RNA interference)可能是进行抗肝炎病毒基因治疗的新策略[4,5].

1 RNA干扰的机制与策略

1995年Guo et al [17]在研究美丽隐杆线虫(C. elegans)的par1基因功能时, 将par1基因的反义RNA表达载体导入到美丽隐杆线虫中, 引起par1基因的缺陷现象, 同时发现导入par1基因的有义链基因进行表达时, 也产生了par1基因的缺陷现象, 表明反义和有义RNA的表达都有类似的抑制效应, 但是机制却明显不同. Fire et al [18]对这一现象的机制进行了细致深入的研究, 比较了反义RNA、有义RNA和双连RNA(dsRNA)在美丽隐杆线虫中的抑制效应, 发现dsRNA产生至少是10倍以上的抑制靶基因表达的效果, 并将dsRNA抑制同源基因的表达的现象称为RNA干扰, 从此RNA干扰现象得到了空前的重视, 并在各种病原微生物的基因表达抑制方面进行了许多有益的尝试.

干扰RNA是生物系统在长期进化过程中形成、天然存在的防御机制之一. 当一种生物系统受到异源性病原体的入侵时, 可以自动开启属于RNase III的核糖核酸酶, 即RNA切割酶(dicer)的活性, 将入侵病原体的RNA成分, 切割处理成21-25 nt的RNA小片段, 发挥RNA干扰(iRNA)的抑制性生物学作用, 参与构筑生物系统的防御机制. 这种生物防御机制, 从低等生物到高等生物都普遍存在, 是生物系统天然存在的重要机制[19-25].

2 RNA干扰与病原微生物基因表达的抑制

在美丽隐杆线虫中发现RNA干扰现象之后, 很快发现在许多类型的病原微生物中都存在同样的RNA干扰现象. 如果蝇、锥虫、涡虫、线虫, 以及高等的哺乳动物细胞, 甚至是人的细胞中也都发现类似的RNA干扰现象. 对其作用机制进行研究, 发现是一些22-25 nt大小dsRNA产生抑制或降解靶RNA分子的作用, 统称为小干扰RNA(small interference RNA, siRNA), 根据其发挥RNA干扰现象的dsRNA的具体长度又可以分成2类: 24-25 nt的长siRNA和21-23 nt的短siRNA. 这两种类型的siRNA都可以通过与靶mRNA分子进行序列特异性的结合、抑制与降解, 阻断或破坏靶基因的表达. 另外一种可能作用的机制就是dsRNA诱导同源基因的甲基化, 从而使目的基因表达关闭. 另外, 小分子的dsRNA同时也是很强的干扰素诱导酶如PKR、RNase L的激活剂, 可以产生类似干扰素的抗病毒效应[26-37].

有多位学者对于人免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1, HIV-1)的siRNA进行了研究. Jacque et al [38]根据HIV-1基因组核苷酸序列, 如长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)、vif和nef基因, 设计了序列特异性的21 nt的siRNA, 无论是人工合成, 还是表达载体在细胞内表达的siRNA分子, 都能够在HIV-1阳性的CD4+ Hela细胞中抑制HIV-1的复制, 导致复制水平下降了30-50倍. 如果siRNA序列与结合的HIV-1序列不配对时, 这种抑制作用有显著降低. 说明siRNA与靶RNA分子之间的配对结合是非常重要的. 除了转染细胞系之外, siRNA在分离的原代HIV-1阳性的淋巴细胞中也具有明显的抑制HIV-1的复制和表达的作用. 更进一步提示了siRNA策略的实际应用前景. Novina et al [39]对于dsRNA分子对于HIV-1的抑制作用进行了研究, 针对gag基因的dsRNA在转染48 h之后, p24蛋白的表达水平显著下降, 即使在HIV-1前基因组DNA与细胞基因组已经发生整合的HIV-1细胞系中, dsRNA也具有显著的抑制HIV-1的复制和表达的作用.

脊髓灰质炎病毒(poliomyelitis virus, PMV)是一种高水平复制的RNA病毒, siRNA策略同样可以产生对于PMV的抑制效应. Gitlin et al [40]分别设计了针对PMV衣壳蛋白、聚合酶编码基因序列的siRNA, 在Hela细胞系上, 可以使PMV的复制水平下降97-99%, 说明产生了非常显著的抑制效应. Caplen et al [41]对于siRNA抑制塞姆利基森林病毒(semliki forest virus, SFV)、登革热病毒(dengue fever virus, DFV)的效果进行了研究. 证实dsRNA策略可以显著抑制C6/36细胞系中SFV、DFV的基因复制和表达.

3 RNA干扰与抗肝炎病毒治疗的应用前景

RNA干扰策略在抗肝炎病毒治疗中首先在HCV的研究中获得了成功. McCaffrey et al [42]设计合成了针对HCV NS5B基因区的dsRNA, 当与NS5B表达载体进行共转染时, 在鼠肝细胞中观察到dsRNA对于NS5B基因的表达水平抑制率达到75%, 如果dsRNA与NS5B的表达载体进行共转染, 抑制率可以达到98%. 说明siRNA策略在抗HCV基因治疗中的应用前景. 多年来由于缺乏合适的HCV感染/转染细胞模型, 因此对于抑制HCV的研究进展缓慢. 近年来关于HCV复制子(replicon)的建立, 使得在细胞系水平上研究siRNA的效果成为可能. Randall et al [43]就利用HCV的复制子细胞模型对于dsRNA抑制HCV RNA复制的效果进行了研究. 在Huh-7细胞系中, dsRNA对于HCV RNA的复制水平具有显著的抑制作用, 而且是剂量依赖性的. 对于dsRNA作用的序列依赖性的特点进行研究, 2株HCV变异株仅有3 nt的序列差别, 只有dsRNA与作用的靶HCV RNA序列完全同源时才具有抑制作用, 因此, dsRNA对于靶基因的表达抑制具有严格的序列特异性的特点. dsRNA对于HCV RNA抑制的作用效果是指数性的, 在4 d之内, 就可以降低HCV RNA的复制水平达80倍. 导入siRNA之后, 可以使98%以上的有HCV RNA复制的细胞不再有HCV RNA的复制, 这些细胞中再也检测不到HCV的抗原表达和HCV RNA的复制. 这些研究结果表明, 基于siRNA的抗HCV 治疗是十分有希望的.

但是, 由于对siRNA的认识时间尚短, 因此目前还没 有具体的siRNA抑制乙型肝炎病毒的研究结果, 但是从目前关于HCV的部分研究结果来看, 从其他类型的病毒的抑制效果来看, siRNA还是具有希望的抗肝炎病毒治疗的新策略. 当然, 由于肝炎病毒RNA分子在体内的二级结构特点, 针对不同基因区段的siRNA的抑制作用效果也肯定有所差别, 因此针对HBV、HCV基因序列的特点, 还需要进行优化, 寻找最为有效的抑制靶点. 作为一种新型的抗肝炎病毒的可能的策略, siRNA也具有其相当明显的局限性[43]. 例如HBV和HCV基因序列高度变异, 存在明显的基因准种(quasispecies)群, 而siRNA对于靶RNA分子的识别, 又是以碱基配对方式进行的, 因此要想全面控制HBV、HCV的复制, 我们就需要无数种序列不同的siRNA分子, 显然是很难做到的. 因此, 我们还必须针对这一特点进行深入细致的研究, 克服这一困难, 使siRNA抑制靶基因的表达策略更能切合临床抗肝炎病毒治疗的需要.

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