乙型和丙型肝炎病毒对细胞周期素及细胞周期素依赖性蛋白激酶的调节

摘要

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关键词: N/A

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Correspondence to: N/A

Received: March 8, 2003
Revised: March 20, 2003
Accepted: April 16, 2003
Published online: August 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)感染与肝细胞癌(HCC)发生发展之间的密切关系, 早已被大量的临床医学和临床流行病学资料所证实[1]. 随着细胞周期(cell cycle)调节的分子生物学机制研究不断深入, 特别是关于细胞周期素(cyclin)、细胞周期素依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)的发现, 使得细胞周期这一经典的概念又有了新的内容, 大大促进了肿瘤形成的分子生物学研究的进展[2]. 多年来积累了丰富的资料表明, HCC与细胞周期调节紊乱有关, HBV、HCV感染可以引起细胞周期调节的紊乱, 这种异常调节, 可以是肝炎病毒蛋白对于细胞周期素、CDK分子的直接调节, 同时也可以通过对于CDK激酶活性具有广泛抑制作用的p21蛋白的异常调节[3-5].

1 肝细胞癌与细胞周期调节异常

哺乳动物细胞的细胞周期受到CDK和CDK抑制因子的共同调节, 这些蛋白表达水平异常或他们之间相互作用的异常, 都将导致肿瘤的发生. Kohzato et al [6]研究了细胞周期素E和CDK2在肝细胞癌中的作用. 对一系列的HCC、肝硬化组织和肝炎组织进行研究, 对LEC近交大鼠的HCC模型也进行了研究, 石蜡切片免疫组织化学技术检测细胞周期素E和CDK2的表达, 人和大鼠的HCC组织中有细胞周期素E和CDK2的共同表达, Western blot杂交以及CDK2蛋白激酶活性的分析结果表明, 细胞周期素E和CDK2蛋白, 以及CDK2的蛋白激酶活性都随着HCC的发展而逐渐升高, 细胞周期素E和CDK2与临床病理特点之间的相互关系研究结果表明, 细胞周期素E与肿瘤的分级、增生细胞核抗原(PCNA)指数、以及CDK2表达等指标之间密切相关. CDK2的过表达似乎与HCC的低度分化有关. 这些研究结果表明细胞周期素E和CDK2在HCC中具有十分重要的作用.

在HBV相关的HCC发展中, 通常需要20-40 a的肝脏炎症、坏死的持续过程. 但儿童期HCC的发生机制与之明显不同. Kim et al [7]发现癌基因c-met的突变仅在儿童期HCC中发现, 成人期HCC没有. 对9例儿童期HCC和9例40岁以上的成年期HCC进行对比研究, G1期调节蛋白如细胞周期素D1、E和CDK4的表达以免疫组织化学技术进行了研究. 同时对于染色体8p、13q、17p的杂合子丢失(loss of heterozygosity, LOH)进行调查. 儿童期HCC的细胞周期素D1表达水平显著低于成年期HCC患者, 但细胞周期素E和CDK4表达水平无明显差别. 染色体13q的LOH频率在儿童期HCC稍高, 8p和17p位点没有显著差别. 结果提示儿童期HCC可能与细胞周期素D1表达水平的异常没有显著的相关性, 但是13q的LOH可能与之有关.

在包括HCC的一些肿瘤中, 经常见到细胞周期素基因的放大现象, 特别是细胞周期素D、E, 是正常细胞恶性转化的重要步骤. 但是大多数细胞周期相关的蛋白激酶的变化及其在肿瘤发生中的作用, 目前还不十分清楚. Masaki et al [8]利用Western blot杂交技术研究了LEC大鼠HCC移植瘤的细胞周期素和CDK的活性, 如细胞周期素D1、E、A、H、CDK1 (Cdc2)、CDK4、CDK6. 细胞周期素D1、E、A、CDK4、CDK6、Cdc2、CDK7、Wee1的活性以胶内激酶(in-gel kinase)活性分析法测定. 在HCC移植瘤中, 细胞周期素D1、E、CDK4、细胞周期素A、Wee1蛋白和激酶活性显著升高, 与HCC进展期显著相关, 特别是在慢性肝炎向HCC转化中尤其如此. 尽管Cdc2在正常、肝炎肝组织中轻度升高, 但在慢性肝炎向HCC的转换过程中却没有显著变化, CDK6、CDK7的蛋白激酶活性也保持不变. 表明Cdc2蛋白激酶在慢性肝炎向HCC的转化过程中具有十分重要的作用, 尤其是细胞周期素D1、CDK4、细胞周期素E、细胞周期素A和Wee1的变化, 可能在慢性肝炎逐渐发展为HCC的过程中具有十分重要的作用.

CDK相关的蛋白磷酸酶(CDK-associated protein phosphatase, KAP)是人的一种双特异性蛋白磷酸酶, 可以催化CDK2在苏氨酸160位点发生去磷酸化, 而且是一种细胞周期素依赖性的过程. Yeh et al [9]对于这种蛋白酶是否在HCC中有突变的现象, 利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对HCC组织中KAP mRNA表达进行了分析. 8/14例晚期HCC活检标本和6/13例外科手术切除的HCC标本以及2例肿瘤周围组织中都有异常的KAP转录表达. 随后对于这些突变的KAP基因进行克隆分析, 酵母双杂交技术分析结果, 发现5/7典型的KAP突变体都失去与CDK2的相互作用. 说明在HCC的形成过程中, KAP突变也是参与其中的一个重要因素.

2 乙型肝炎病毒与细胞周期调节异常

有丝分裂细胞周期素组成了组蛋白H1激酶复合物的调节亚单位. 根据细胞周期素的一级结构可以分成A、B2种, 都是细胞有丝分裂调节所必需的调节蛋白. 细胞周期素A激活组蛋白H1激酶的活性, 蛋白裂解破坏在细胞周期素B之前, 在DNA复制过程中具有十分重要的调节作用. 细胞周期素A和B在肿瘤发生中具有一定的作用, 机制不同, 象HBV DNA与细胞周期素A之间的结合及功能异常, 或者作为一种复合物形式产生异常调控, 或在癌基因或癌基因异常情况下, 在CDK催化作用下发生异常磷酸化修饰.

细胞周期素在所有的真核细胞的细胞周期调节中都具有十分重要的意义. 细胞周期素A在HBV DNA的整合以及HCC的发生中具有重要的意义, 此外与细胞周期素A转录因子蛋白E2F结合成复合物形式, 腺病毒的E1A可以阻滞这种蛋白复合物的形成. 这些研究结果表明细胞周期素A是肿瘤形成信号作用的一个靶点. 将抗细胞周期素A的抗体注射入细胞内之后, 细胞的DNA合成及进入有丝分裂的细胞数目受到严重影响. 细胞周期素A与CDK2和Cdc2都能结合, 说明具有2种不同的激酶活性. 一种活性在S期发挥作用, 另一种活性在G2期发挥作用. 这些结果表明, 细胞周期素A是人细胞周期调节的一个重要环节.

HBV的pX蛋白在慢性HBV感染者的HCC发生中有一定的作用. 为了研究pX在细胞恶性转化中的作用, Lee et al [10]应用永生化的AML12肝细胞建立了分化型细胞模型3pX-1和去分化型细胞模型4pX-1, 但只有3pX-1出现pX介导的恶性转化, 信号转导涉及Ras-Raf-MAPK的激活. 表达pX的非转化型4pX-1细胞表现出持续的、pX依赖性的JNK信号系统的激活. 对于pX介导的这2种不同的生长方式进行比较, 对3pX-1、4pX-1细胞周期的特点进行了研究. 表达pX的转化型3pX-1表现出pX依赖性的G1、S、G2/M期进展, 其标志是细胞周期素D1、A、B1的诱导, Cdc2激酶的激活. 表达pX的非转化型4pX-1细胞系表现出pX依赖性G1、S期的进入, 之后是S期的停滞, 没有Cdc2激酶的激活. 有意思的是4pX-1具有pX诱导的p21(Cip1)、p19 (ARF)、bax、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)的表达. 尽管pX介导的生长抑制和细胞凋亡基因的表达, 还有pX依赖性Cdc2激活的缺乏, 4pX-1细胞并没有pX依赖性的G2/M的阻滞或细胞凋亡. 诺考达唑(Nocodazole)处理后, G2/M期阻滞的4pX-1细胞表现出pX依赖性的多形核细胞的形成, 类似表达人嗜T 淋巴病毒I(HTLV-I)的Tax蛋白的细胞特征. 因此认为4pX-1细胞中, 因为pX异常调节了G2/M的细胞周期检验点, 因而免于pX表达诱导的细胞凋亡过程的发生.

几项研究结果提示HBxAg可与cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)结合, HBxAg也能促进早期的细胞周期进展, 可能的机制就是代替TATA结合蛋白相关因子250 (TATA-binding protein-associated factor 250, TAF(II)250)的功能, 或者刺激细胞质中的信号转导系统. 为了研究HBxAg对于细胞早期阶段的影响机制, Bouchard et al [11]研究了HBxAg促进处于生长阻滞阶段细胞通过G0和G1期检验点的作用和机制. 结果证实TAF(II)250是HBxAg激活细胞周期素A启动子所必须具备的因子, 也是HBxAg促进细胞从G0到G1期的转变. HBxAg在功能上并不是替代TAF(II)250, 而是HBxAg激活细胞周期素A的启动子转录活性, 诱导细胞周期素A-CDK2复合物蛋白激酶的活性, 促进静止期细胞进入到G1期, 主要机制就是通过Src酪氨酸蛋白激酶的激活. HBxAg刺激Src蛋白激酶的活性以及细胞周期素的基因表达, 强迫处于静止期的细胞进入到G1期, 但在S期速度减慢, 更有利于病毒的复制.

HBxAg是一种分子量很小的转录激活因子, 是病毒的感染所必需的. HBxAg与HBV基因的转基因小鼠肝脏肿瘤的发生发展有关. HBxAg激活Ras-Raf-MAPK信号转导链, 激活转录因子蛋白AP-1和NF-κB, 刺激细胞DNA的合成. Benn et al [12]的研究结果表明HBxAg可以刺激细胞周期的进展, 缩短细胞在G0的时间至少12 h, 加速进入到S期, 同时也加速细胞通过G0/G1和G2/M2个细胞周期检验点. 与血清因子的刺激相比较, HBxAg蛋白可显著增加CDK2和CDC2蛋白激酶的活性, 以及分别与细胞周期素E、A或B结合而成的复合物的蛋白激酶活性. HBxAg基因的表达可以导致细胞克服细胞对于血清的依赖性或显著降低由此带来的细胞生长抑制. HBxAg和血清刺激都需要RAS信号转导通路的参与, 但只有HBxAg可以缩短检验点所需要的时间. HBxAg因此通过RAS信号转导途径促进细胞生长, 与此过程相关的另外第二种因素可以持续激活JUN或p53蛋白, 也参与了这一调节过程. 这些研究结果表明HBxAg参与了HBV感染引起肝脏肿瘤的过程, 主要机制是导致细胞周期检验点的异常, 对于遗传特性不稳定的细胞进行选择, 并积累不能进行修复的致癌突变.

HBV核心蛋白的磷酸化修饰是前基因组RNA包装成病毒核颗粒的先决条件, 但是究竟是细胞内什么样的蛋白激酶催化HBV核心蛋白的磷酸化修饰一直不十分清楚. Daub et al [13]对于HuH-7细胞中95和115 kD的2种蛋白激酶的活性进行研究, 因为研究提示这2种蛋白可以与HBV核心蛋白结合, 而且可以使HBV核心蛋白的富含精氨酸残基的羧基末端发生磷酸化修饰. 95 kD 的蛋白激酶纯化以后, 发现是与SR蛋白特异性激酶1(SR protein-specific kinase 1, SRPK1), 基于这些发现, 115 kD的蛋白激酶可以看作是相关的一种蛋白激酶, 即SRPK2. 在体外, 这2种SRPK都可以催化HBV核心蛋白的磷酸化修饰, 而且磷酸化修饰的位点相同, 都是同一个丝氨酸位点, 与体内的磷酸化修饰一样. 在总的细胞裂解液中, 主要的HBV核心蛋白激酶活性与SRPK1、SRPK2蛋白激酶活性相同. 研究结果还清楚地表明, 以前曾经认为在HBV核心蛋白磷酸化修饰中具有重要作用的蛋白激酶Cdc2、CDK2、PKC都没有催化HBV核心蛋白磷酸化修饰的活性. 研究结果表明, SRPK1、SRPK2是HBV感染过程中催化HBV核心蛋白磷酸化修饰的主要的蛋白激酶, 可能是设计抗HBV治疗药物的一个新型靶位.

嗜肝病毒都是具有包膜的病毒, 其基因组DNA包裹到核壳体中, 完成病毒DNA的复制和合成. 当有病毒包膜蛋白时, 含有DNA的核壳体可以装配成完整的病毒, 但当没有病毒的包膜蛋白时, 核壳体就将其中的病毒DNA运送到细胞核中, 这一步就象是病毒刚开始感染时病毒DNA的运送方式, 但是触发亚病毒核壳体中DNA向细胞核运送的机制目前还不十分清楚. Barrasa et al [14]在HBcAg分子的结构中鉴定出一类似丝氨酸或苏氨酸激酶的识别位点, 是核壳体形成的一个关键结构位点. 应用鸭乙型肝炎病毒(DHBV), 证实这一位点的突变对于DNA的装配、DNA的复制和核心蛋白的稳定性等都具有十分显著的影响. 这一结构位点的序列特征还是病毒复制所在的细胞类型依赖性的.

3 丙型肝炎病毒与细胞周期调节异常

HCV核心蛋白在肝细胞癌中具有十分重要的地位. Cho et al [15]对HCV核心蛋白通过对细胞周期素E的调节, 促进细胞增生的作用进行了研究. HCV核心基因稳定转化的大鼠细胞系Rat-1与母本细胞相比较细胞增生率显著升高, 细胞周期素E的表达与相关的蛋白激酶的活性在HCV核心基因稳定转染的细胞系中显著升高. 在HCV核心基因转染的细胞系中, 细胞周期素E mRNA的转录水平也显著提高. 认为HCV核心蛋白具有促进细胞增生的作用, 主要机制就是通过对细胞周期素E表达的调节, 说明HCV 核心蛋白在HCC的形成过程中具有十分重要的作用.

4 肝炎病毒与p21基因调节异常

肝细胞增生率的增加是发生肝细胞癌的一个危险因子, Lee et al [16]研究了小鼠成纤维细胞NIH 3T3中HCV核心蛋白对于CDK抑制因子p21蛋白编码基因启动子的活性的抑制作用. 通过p21基因启动子报告基因表达载体的瞬时转染实验结果表明, 转化生长因子β(TGF β)应答元件(TGF-β-responsive element, TβRE)位于p21基因启动子的-83~-74 nt之间的核苷酸序列, 是其应答的结构基础. TGFβ诱导p21启动子的转录活性, 受到HCV核心蛋白的显著抑制, 在Smad7存在条件下, 这种抑制作用几乎是完全的. HCV核心蛋白可以刺激NIH 3T3细胞的生长, 可以克服TGF β诱导的生长抑制作用, 但不能克服丁酸盐(butyrate)的生长抑制作用, 表明HCV核心蛋白是通过TGF β信号途经抑制p21的转录表达来实现促进细胞的生长作用的.

HBV和HCV重叠感染十分常见, 而且可以引起更重的肝病, 增加罹患HCC的几率. Han et al [17]的研究结果表明, HBxAg与HCV核心蛋白在抑制p21基因表达方面具有相加作用, p21基因启动子序列中的TβRE和Sp1位点分别是HCV核心蛋白和HBxAg的调节作用位点. 这2种病毒蛋白对于细胞生长的促进作用也具有相加性质, 可以认为是HBV和HCV共同促进HCC的发生.

Yoshida et al [18]研究了HCV核心蛋白对于培养的细胞中的p21/Waf1/Cip1/Sdi1(p21/Waf1)的调节作用, 尽管没有证据表明HCV核心蛋白与p21/Waf1蛋白在细胞内分布在同一位点, 表达HCV核心蛋白的细胞比正常对照细胞中p21/Waf1的表达显著减弱, 但Northern blot结果表明2种细胞p21/Waf1 mRNA水平很接近, 说明HCV核心蛋白抑制p21/Waf1的表达发生在转录后水平. p21/Waf1蛋白的降解在2种细胞系中没有显著差别, 表明p21/Waf1蛋白在2种细胞系中的稳定性没有显著差别, 但这种蛋白在细胞中积聚时, HCV核心蛋白对之没有显著的影响. 因此要考虑到p21/Waf1蛋白的合成、成熟、细胞和转运等环节是否有障碍, 或仅仅是对新合成的蛋白有降解作用. 在2种细胞系中, p21/Waf1在细胞内的积聚可以部分地被蛋白体抑制物和钙相关蛋白(calpain)抑制物所抑制. 体外激酶活性分析结果表明, p21/Waf1对CDK2激酶活性具有抑制作用, 而HCV核心蛋白可以部分恢复这种抑制作用. 综合上述结果, HCV核心蛋白抑制p21/Waf1蛋白表达的作用是在转录后水平上, 影响p21/Waf1在细胞中的功能.

HBV X蛋白可以改变细胞对于细胞凋亡诱导因素作用的敏感性, 也可以对于细胞周期进行异常调节. Park et al [19]对于p53基因发生突变的HCC细胞系Hep3B进行了研究, 在稳定表达X蛋白的Hep3B细胞系中, p21(waf1/cip1)蛋白和mRNA水平显著升高, 与CDK2之间的结合能力增加, 但显著抑制细胞周期素E与CDK2之间的结合, 以及组蛋白H1的磷酸化修饰. 利用基因突变技术证实, X蛋白对于p21启动子应答的序列在转录起始位点上游的-1185至-1482 nt之间. 对p21启动子基因区的突变研究结果表明, HBV X蛋白的应答位点位于ets因子结合位点处. 这一研究结果表明, 在肝癌细胞中, X蛋白可以克服p53基因丢失的效应, 直接引起其下游信号转导途径的改变, 因此认为p21(waf1/cip1)在HCC发生过程中, 特别是在p53基因缺失条件下, 具有十分重要的地位和作用.

p21蛋白是一种CDK蛋白激酶广谱的抑制因子, 在肝再生过程中对于肝细胞的细胞周期也有显著的调节作用. Crary et al [20]应用免疫组织化学技术对p21蛋白、Ki-67在肝脏疾病中的作用和意义进行了研究. 正常的肝细胞和非酒精性脂肪肝炎(NASH)肝脏中p21、Ki-67表达水平很低, 在酒精性肝炎肝脏中表达水平显著升高. 在慢性丙型肝炎患者中, p21表达与Ki-67显著相关, 而且与炎症和肝纤维化的分级、分期显著相关. 说明在炎症中, 肝损伤可以诱导p21的表达, 而且与肝脏炎症和肝纤维化的程度有关[21-24].

备注

$[Footnotes]

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