乙型和丙型肝炎病毒蛋白对于细胞周期素A的调节研究

摘要

N/A

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: March 8, 2003
Revised: March 20, 2003
Accepted: April 16, 2003
Published online: August 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

细胞周期(cell cycle)是细胞分裂增生的经典概念, 过去的研究主要集中在细胞周期的形态学描述上. 随着细胞周期素(cyclin)和细胞周期素依赖性激酶(cyclin dependent kinase, CDK)的发现及其作用机制的研究进展, 使得我们对于细胞周期调节有了分子生物学水平上的深入认识. 细胞周期的分子生物学调节机制的研究, 也促进了肿瘤形成的分子生物学机制的研究, 同时对于肿瘤病毒(oncogenic virus)引起正常细胞的恶性转化机制的研究具有十分重要的促进作用.

从广义上来讲, 乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)都属于肿瘤病毒的范畴, 因为这两种肝炎病毒的感染与肿瘤的发生有着十分密切的关系, 特别是与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发生发展密切相关, 这在分子生物学研究和临床流行病学调查资料中都得到了很好的反映. 目前已经积累的研究资料表明, 这些病毒引起正常肝细胞的恶性转化, 也与细胞周期的异常调节有关. 其中肝炎病毒蛋白对于细胞周期素A(cyclin A)的异常调节是其主要机制.

1 细胞周期素A的发现和生物学作用

目前关于细胞周期素和CDK的认识已经相当深入和系统, 已经发现了众多的细胞周期素和CDK分子类型, 对于他们的作用机制也有了清楚的了解, 大大推动了肿瘤分子生物学的研究. 但是, 关于细胞周期素的发现首先还是从HCC的研究开始的. Wang et al [1]在研究肝细胞癌时, 发现HBV DNA在肝癌细胞基因组DNA的整合位点, 正好是一个肝细胞的编码基因区, 对于这一基因区的序列进行对比分析, 发现这一段基因序列正好是低等动物细胞周期素A编码基因的同源基因, 从而导致了人细胞周期素A基因的发现. 这一研究以及之后的一系列研究结果表明, HBV DNA整合的位点正是人细胞周期素A的内含子(intron)区, 从而形成了HBV表面抗原基因与细胞周期素A的融合基因, 这种整合造成了细胞周期素A基因的表达在HBV的表面抗原基因启动子的控制之下, 同时, 由于融合蛋白中缺失的氨基末端的序列, 正好是与细胞周期素A蛋白降解有关的序列, 从而造成持续表达和不能降解, 这样细胞就受到持续的细胞周期素A的刺激, 造成异常的信号转导, 与HCC的发生发展关系密切. Wang et al [2]不仅发现了HBV DNA与肝细胞基因组DNA整合的位点, 而且据此还发现了细胞周期素A, 随后又建立了HCC的cDNA文库, 从中鉴定、分离到数个HBV-细胞周期素A杂合子的分子克隆. 杂合分子cDNA编码HBV-细胞周期素A的融合蛋白, 在这一融合蛋白分子中, 在细胞周期素A的N-端缺失了一段功能序列, 包括细胞周期素降解所必需的结构, 代之以病毒的前-S2/S序列, 整个融合蛋白在病毒的前-S2/S启动子的指导下进行. 这种融合蛋白在体外的细胞周期素降解实验中不被降解, Northern blot杂交分析结果表明这种杂合分子在肿瘤组织中的转录表达水平很高, 但是在同一患者的非肿瘤组织中却没有检测到这种融合蛋白的表达. HBV DNA与细胞周期素A基因的整合造成了很强的HBV-细胞周期素A杂种分子的转录表达, 编码一种不被降解的细胞周期素A分子, 这种杂合分子在肿瘤形成过程中具有十分重要的意义.

细胞周期素A基因首是在肝癌组织中HBV DNA整合的位点研究中发现的, 染色体定位在4q27, 与原发性肝癌(PLC)经常出现基因重排的染色体位点4q32距离不远. De Mitri et al [3]建立了细胞周期素A基因的TaqI位点多态性研究手段, 对于细胞周期素A 基因的等位基因丢失情况进行了聚合酶链反应(PCR)检测. 50例PLC患者肿瘤和非肿瘤组织的检测结果表明, 54%为A1型纯合子, 6%为A2型纯合子, 40%为杂合子. 比较肿瘤和非肿瘤组织, 5%为纯合子. 认为细胞周期素A等位基因的丢失在PLC中不是十分常见, 当只有有限的DNA标本时, PCR技术是检测细胞周期素A等位基因丢失的可靠技术手段.

目前已知细胞周期素A和B是细胞周期调节中最为主要的调节因素. 这两种细胞周期素在细胞周期的调节中均具有十分重要的调节作用, 只是在细胞周期调节过程中发挥作用的先后次序不同. 细胞周期素A主要作用在细胞周期的早期阶段, 而细胞周期素B主要作用在细胞周期的晚期阶段. 其机制主要是通过与不同形式的CDK分子的结合和调节. 此外, 细胞周期素A主要调节DNA的复制, 细胞周期素B主要是抑制早期核内体(endosome)以及cdc25磷酸酶的激活. 细胞周期素A、B异常与肿瘤形成的关系也十分密切.

2 细胞周期素A与肝脏疾病之间的关系

Zhang et al [4]研究了HCC肝组织中细胞周期素A过表达的情况, 以及HBV X基因与肝细胞基因组DNA整合的情况. 对于HCC癌组织和癌周组织细胞周期素A的mRNA、蛋白表达水平以及HBV X基因的表达进行了研究, 结果仅在1/35例患者中检测到细胞周期素A基因放大, mRNA 和蛋白的表达水平升高分别见于16/35, 21/35例患者, 细胞周期素A基因的过表达与患者的年龄、肿瘤大小、HBV X基因的整合显著相关. 因此认为, 细胞周期素A在HCC形成的早期阶段就有过表达现象. 这也是HBV改变肝细胞的细胞周期调节的重要机制.

在许多类型的肿瘤中, 包括HCC, 细胞周期素基因放大是十分常见的, 特别是细胞周期素D和E. 在HCC中有一系列的细胞周期相关的蛋白激酶活性处于异常状态. Masaki et al [5]对于LEC大鼠中HCC移植瘤的这些蛋白激酶的活性进行研究. 对于不同期的HCC组织中细胞周期素D1、E、A、H, Cdk1 (Cdc2)、Cdk4、Cdk6蛋白水平以Western blot技术进行检测. 对于细胞周期素D1、E、A、Cdk4、Cdk6、Cdc2、Cdk7、Wee1激酶的活性应用胶内激酶(in-gel kinase)活性分析技术检测. 细胞周期素D1、E、Cdk4、细胞周期素A和Wee1等的蛋白水平和激酶活性升高与HCC的分期呈正相关, 特别是在慢性肝炎向HCC转化的过程中尤其如此. 尽管慢性肝炎与正常的肝脏相比较Cdc2激酶活性轻度升高, 但在慢性肝炎向HCC转化的过程中却没有显著的改变. 在正常的肝细胞向HCC的转化过程中, Cdk6和Cdk7活性保持不变. 这些结果表明, Cdc2激酶活性的升高在正常肝细胞的恶性转化过程中具有十分重要的地位, 细胞周期素D1、Cdk4、细胞周期素E、细胞周期素A和Wee1在这些过程中可能没有特别重要的意义.

Werling et al [6]对于慢性丙型肝炎患者的肝细胞的DNA多倍体性质以及细胞的增生状态进行了研究. 45例慢性丙型肝炎患者和27例非丙型肝炎患者的研究结果表明, 慢性丙型肝炎患者S期细胞数目比例轻度下降, 炎症指数和细胞周期素A蛋白表达水平也有一定程度的下降, 主要发生在几例重症肝炎患者中. 在非慢性丙型肝炎患者中, 细胞周期素A阳性细胞数目与炎症程度相平行. 另外, HCV感染还可以引起接近二倍体的非整倍体的细胞DNA, 而病理指数与二倍体状况无关. 这些研究结果表明, 慢性丙型肝炎患者的肝细胞增生状态受到抑制, 且与炎症程度成平行的关系, DNA多成非整倍体状态. DNA的非整倍体状态是遗传不稳定的表现和信号, 最终会导致正常细胞的恶性转化.

细胞周期素A是S和G2/M期中的调节蛋白, 这些调节蛋白的异常表达与正常细胞的恶性转化有关. Chao et al [7]研究了细胞周期素A过表达以及其与HCC临床预后之间的相互关系. 研究发现, 39%(12/31)的患者有细胞周期素A的过表达, 在6/12患者可以发现基因放大, 4/12的患者是转录后效应, 2/12例患者是翻译后效应. 与细胞周期素A表达水平正常的肿瘤组织相比较, 具有细胞周期素A过表达的患者, 则具有更多的处于S和G2/M期的细胞. Skp2是一种细胞周期素A作用蛋白, 在55%(17/31)的患者中发现有过表达现象. 这些患者也具有较多的处于S期的肿瘤细胞. 经过非配对Student's t检验、精确Fisher's 检验和χ²分析, 证实细胞周期素A的过表达与Skp2表达水平升高有关, 同时与甲胎蛋白(AFP)表达水平升高有关, 但是与患者的年龄、肿瘤大小、是否合并肝硬化、HBsAg检测结果是否阳性等因素无关. 在无病生存期分析中, 有细胞周期素A过表达的患者平均是6 mo, 而没有细胞周期素A过表达的患者是29 mo. 总体的生存分析结果表明了同样的趋势, 即细胞周期素A过表达的患者的生存期限较短. 多变量分析(multivariate analysis)结果表明, 根据Skp2过表达和AFP水平进行调整之后, 仍然发现细胞周期素A的过表达与无病生存期有显著相关的关系. 这些研究结果提示细胞周期素A是HCC独立的预后相关因素.

在实验动物和肝脏疾病患者的临床标本中, 无论是良性还是恶性疾病, 都可以检测到肝细胞生长因子(HGF)及其受体c-met的过表达. 以免疫组织化学技术, 对于20例HCC患者、5例局灶结节增生(focal nodular hyperplasias, FNHs), 4例爆发性肝炎(fulminant hepatitis, FH), 1例再生肝脏检测了HGF、c-met的表达. c-met这种原癌基因在所有的组织中都有表达活性, 尤其在HCC表达水平更高. HGF在所有组织的肝脏贮脂细胞中都能检测到, 在45%(9/20)的HCC组织也能检测到在肝细胞中HGF的表达. 以细胞周期素A的多克隆抗体对于增生指数进行研究, HGF和c-met表达水平和细胞周期素A阳性细胞核比率进行比较, c-met与细胞周期素A的表达之间存在显著的相关性. 55%(11/20)的HCC组织中HGF和细胞周期素A阳性之间没有显著的相关性. 研究提示HGF、c-met的表达是肝细胞增生的最为明显的促进因素.

细胞周期素A在细胞周期的S和G2/M期具有十分重要的调节作用, 其基因组也是HCC组织中HBV DNA整合的常见位点. Paterlini et al [8]对于PLC肿瘤和非肿瘤组织中的细胞周期素A进行了研究, 包括肝脏肿瘤组织中细胞周期素A的基因重排、细胞周期素A的表达与增生细胞比率之间相关的特点等. 对43例患者的标本进行了Southern blot杂交检测. 细胞周期素A的RNA水平的累积在18例患者是明显存在的, 与S+G2/M期细胞的比率显著相关. 本项研究中没有发现细胞周期素A的基因重排现象, 细胞周期素A的RNA水平与S+G2/M期的细胞比率之间存在极为显著的相关性. 体内研究证实细胞周期素A的RNA与PLC肝组织中增生细胞的比率之间存在极为显著的相关性. 因此认为细胞周期素A是肝脏肿瘤细胞显著增生的主要的生物学标志物.

尽管目前已经确定HCV是非甲非乙型肝炎(non-A, non-B hepatitis)的主要病原体, 但是仍然存在一部分患者, 组织学具有慢性病毒性肝炎的特征, 但是血清学标志物却是阴性. Romeo et al [9]应用PCR技术对于诊断明确的慢性活动性肝炎患者的17份血清标本和6份肝脏活检标本的HBV DNA和HCV RNA进行检测, 4/17血清标本中可以检测到HCV RNA, 但HBV DNA全部阴性. 3/6份肝脏活检标本中细胞周期素A和人白细胞抗原(HLA)阳性. 其中1例HCV RNA阳性, HBV DNA阴性. 这一研究结果表明, 除了HBV、HCV之外, 可能还会存在其他类型的肝炎病毒.

3 肝炎病毒蛋白对于细胞周期素A的调节机制

细胞周期素A2主要存在于细胞周期G1/S转变期间的细胞核之中, 在核膜遭到破坏之后的有丝分裂期就开始降解, 先前的研究发现存在细胞周期素A2与HBV表面抗原基因融合蛋白(S2A), 细胞周期素A2部分就是不被降解的结构区δ152, 位于内质网膜上, 可以逃避正常大鼠成纤维细胞的降解途径, 因此怀疑细胞周期素A2在肿瘤形成过程中发挥一定的作用. Faivre et al [10]的结果表明, 如果将不易降解的细胞周期素A2-δ152融合蛋白, 以细胞内质网定位信号PRL-A2将其固定在内质网上, 就可以与Ha-ras一起促使正常细胞的恶性转化. 持续表达PRL-A2的细胞REF52具有较高比例的多核巨大细胞的比率, 经常看到多倍体细胞和异常的中心粒数目的细胞, 产生多极的纺锤体. 将这些细胞注射到去胸腺的小鼠中, 可以引起肿瘤, 有时在没有Ha-ras辅助的情况下也能发生肿瘤. 这些研究结果表明, 不易降解的细胞周期素A2在细胞内质网内的异常分布, 就可以干扰正常的细胞周期, 促进细胞产生非整倍体状态, 进而产生肿瘤.

HBV X在慢性乙型肝炎患者的肝细胞癌的发生发展过程中具有重要作用. pX主要是通过激活RAS-RAF-MAPK和JNK信号转导途径促进正常肝细胞的恶性转化. 为了探讨pX在肝细胞恶性转化过程中的作用机制, Tarn et al [11]构建了受四环素调控的pX表达系统, 并建立了稳定表达的细胞系AML12, 包括分化型细胞系3pX-1和去分化型细胞系4pX-1. 研究结果表明, pX条件表达只能使3pX-1细胞系发生恶性转化, 体内外的激酶活性分析结果表明, pX可以反向激活3pX-1细胞系RAS-RAF-MAPK和JNK的信号转导系统, 而在4pX-1细胞系中不同. 在pX转化的3pX-1细胞系中观察到持续的pX依赖性的RAS-RAF-MAPK信号转导系统的激活. 在非转化的4pX-1细胞系中仅观察到pX依赖性的JNK信号转导系统的激活. 不同的pX依赖性有丝分裂原信号激活途径可以激活不同的cAMP应答元件(CRP)的结合蛋白和c-Jun, 决定了3pX-1和4pX-1细胞系不同的应答特点. 具有核定位信号的pX-NLS表达型细胞系, 可以激活RAS-RAF-MAPK信号转导途径, 显著降低恶性转化的潜能, 说明持续的pX介导的RAS-RAF-MAPK信号转导系统在肝细胞恶性转化过程中具有十分重要的意义.

多项研究证实HBxAg可促进多个信号转导途径, 还可以与多种转录因子蛋白结合, 特别是cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB). HBxAg具有促进细胞周期早期进程的作用, 可能的机制是替代TATA结合蛋白相关因子250(TATA-binding protein-associated factor 250, TAF(II)250)这种转录激活共刺激因子的作用, 或者是刺激细胞质中的信号转导系统. 为了研究HBxAg在细胞周期早期阶段的调节作用, Bouchard et al [12]研究了HBxAg对于G0/G1期细胞检验点的异常. 发现TAF(II) 250是HBxAg激活细胞周期素A基因启动子和促进G0/G1细胞周期进展的必须依赖的因素. 因此, HBxAg在功能上不能替代TAF(II)250在转录激活和细胞周期调节中的作用, 相反, HBxAg具有激活细胞周期素A基因启动子的活性, 诱导细胞周期素A-CDK2复合体的形成, 促进静止期细胞进入G1期, 主要机制是通过对于Src酪氨酸激酶活性的激活. HBxAg刺激Src激酶活性, 促进细胞周期素基因表达水平的提高, 完成促进静止期细胞向G1期的转化, 但在S期附近就失去作用, 这可能是病毒复制过程中非常重要的事件.

细胞周期素在真核细胞的细胞周期调节中具有十分重要的作用. 人细胞周期素A的发现是在研究HCC的HBV DNA整合位点的基因序列时实现的. 人细胞周期素A与E2F转录因子的活性相关, 人乳头瘤病毒(HPV)E1A癌基因蛋白也可以与之结合, 这些发现说明细胞周期素A与肿瘤的信号转导环节有关. 以抗人细胞周期素A的抗体进行细胞内注射时, 细胞的DNA合成受到抑制, 进入到有丝分裂期的进展也受到抑制. 细胞周期素A与cdk2和cdc2结合, 使得细胞周期素A具有2种截然不同的激酶活性, 一种是在S期, 另外一种是在G2期. 这些结果说明细胞周期素A对于人细胞的细胞周期具有显著不同的调节机制.

细胞周期素是细胞周期的重要调节因素, 在正常细胞的恶性转化过程中具有十分复杂的作用. Berasain et al [13]描述了一种新型的细胞周期素肿瘤激活方式. 细胞周期素A2的氨基末端部分如果被HBsAg部分编码序列所代替形成融合蛋白S2A时, 可以引起正常大鼠肾细胞的恶性转化, 还可以与ras一起转化大鼠胚胎成纤维细胞. 但是病毒蛋白基因和全长的细胞周期素A2或者是氨基末端缺失突变的细胞周期素A2都没有这种恶性转化作用. 融合蛋白S2A的恶性转化作用主要是因为具备与CDK分子的结合和激活作用. 这种融合蛋白如果在MRAIL序列发生突变, 那么就可以导致恶性转化作用的消失. 这种作用主要是与融合蛋白在内质网膜上的异常分布有关. 这些结果提示病毒感染之后造成的细胞周期调节蛋白在细胞内的分布异常, 是病毒感染引起正常细胞发生恶性转化的重要机制之一.

HBV感染可引起从急性病毒性肝炎到HCC的各种各样的临床表现. 在HBV基因组中存在数个启动子序列, 其转录活性受到肝细胞中转录因子蛋白的调控. HBV基因组编码的pX蛋白是目前唯一已知的病毒调节蛋白, 在HBV的基因表达调节中具有十分重要的作用. Haviv et al [14]研究了pX蛋白与细胞辅助激活因子之间的相互关系. pX可以重建野生型蛋白的激活功能, 代替与TAFII250和激活剂结合活性较弱的TBPAS突变. 温度敏感性细胞系ts13在限制温度条件下发生生长停止和细胞凋亡, 但转染pX基因之后可以得到部分恢复, 因此形成了pX依赖性的细胞生长. 这些研究结果表明pX可以抑制某些TBP和TAF(II)250突变表性, 说明pX可以使细胞克服对于holo-TFIID转录复合物的需要.

细胞周期素A可以结合p34cdc2和p33cdk2蛋白激酶, 在G1/S和G2/M两个检验点中都有十分重要的调节作用. 这种细胞周期素自身结合成多聚体形式, 并与E2F转录因子复合物、p33cdk2蛋白激酶和p107结合成蛋白复合体. 细胞周期素A是细胞周期的重要调节因子, 同时也是连接癌基因与抗癌基因之间的联系蛋白. 细胞周期素A在腺病毒感染细胞中与E1A病毒蛋白结合, 说明与肿瘤的形成过程有关. 在肿瘤研究中, 细胞周期素A还可以作为肿瘤形成的一个标志. Wolowiec et al [15]有丝分裂有关的细胞周期素构成了组蛋白H1激酶复合物的调节亚单位. 根据其结构特点可以分成A、B两大类, 对于有丝分裂过程都是必须的. 细胞周期素A激活组蛋白H1激酶, 降解过程早于细胞周期素B, 在DNA的复制过程中具有十分重要的作用. 细胞周期素A、B在肿瘤形成过程中的作用机制, 或者是直接激活细胞周期素A的表达, 例如HBV DNA与细胞周期素A基因的整合和过表达或是与调节细胞增生的调节因子相结合, 或者是间接引起一些癌基因、抗癌基因蛋白的CDK依赖性的磷酸化修饰.

Strassburg et al [16]的研究结果表明细胞周期素A还是抗细胞核抗体(ANA)识别的一种靶抗原. 研究选择了I型自身免疫性肝炎(AIH)患者61例, II型AIH患者21例, 原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者107例, 还有风湿性疾病如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、混合型结缔组织病(MCTD)患者共42例和正常对照人群100例. 以间接免疫荧光技术检测ANA, 以杆状病毒载体-昆虫细胞系表达的细胞周期素A作为抗原检测特异性抗体. 结果表明, I型AIH患者和类风湿性关节炎患者可以检测到ANA. 抗细胞周期素A抗体的阳性率分别为12/61(20%)和6/42 (14%). 在PBC患者、III型AIH患者和正常对照组ANA抗体阴性, 抗细胞周期素A自身抗体的阳性率为7-9%, II型AIH和SLE患者中检测不到. 某些患者的血清中可以检测到细胞周期素A的自身抗体. 抗细胞周期素A抗体可以识别45和50 kD等2种分子量大小的蛋白, 说明这一抗体识别不同的抗原表位. 这一研究发现细胞周期素A是肝脏和非肝脏自身免疫性疾病时产生的自身抗体识别的靶抗原. 进一步的研究将阐明这一自身抗体的产生所具有的生物学和临床医学意义. 细胞周期素A自身抗体的存在, 说明这一细胞周期调节因子的生物学活性还有其他类型的调节途径.

Blanc et al [17]对于人肝细胞受到表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、爆发型肝炎患者血清等刺激时的应答及其机制. 人肝细胞在包被胶原的培养板上培养. 铺板12 h之后, 分别以EGF(1-100 ng/mL)、TGFα(1-100 ng/mL)或血清(1-100 ml/L)刺激0-96 h. 以³H-胸腺嘧啶核苷掺入测定DNA的合成. 同时测定细胞周期素A表达水平和DNA含量, 对于细胞进行计数. DNA高峰在刺激之后的48 h, 细胞在受到20 ng/mL的EGF、40 ng/mL的TGFα或50-100 ml/L的爆发性肝炎患者的血清刺激之后, 与未刺激的细胞相比较, 其生长指数分别提高4. 35、5. 4和4-6倍. 细胞周期素A表达的最高水平也是DNA合成的最高时间点. 72 h之后, DNA合成水平降低75-100%, 细胞数目降低50%. 这些研究结果表明成人肝细胞对于有丝分裂原的刺激具有明显的应答潜力.

利巴韦林是一种鸟嘌呤核苷类似物, 与干扰素联合治疗慢性丙型肝炎可以显著改善慢性丙型肝炎患者肝组织的病理改变, 降低血清转氨酶的水平, 即使单独使用利巴韦林时也能取得一定的治疗效果. 利用体外培养的原代人和大鼠的肝细胞, Ilyin et al [18]研究了利巴韦林对于肝细胞的作用. 在10-60 μmol/L的浓度条件下, 利巴韦林可以抑制蛋白的合成与分泌, 而且这种抑制作用是时间和剂量依赖性的特点, 这些作用通过对血清白蛋白和肝脏球蛋白的测定得到证实. ³H-胸腺嘧啶掺入实验结果表明, 利巴韦林对于HGF、EGF刺激的效应具有显著的抑制作用. 利巴韦林对于DNA合成的抑制, 造成细胞进入细胞周期的S期进展缓慢. 这些结果以流式细胞学技术得到证实. 细胞周期素A和cdc2等在细胞周期S期表达的蛋白的水平也受到抑制[19-25]. 50 μmol/L的利巴韦林对于DNA合成的抑制, 当加入80 μmol/L鸟嘌呤时就可以得到逆转. 这些研究结果表明, 接近治疗剂量的利巴韦林, 在体外就可以影响肝细胞的功能, 因此必须考虑应用补充鸟嘌呤的办法拯救利巴韦林带来的肝细胞抑制作用.

备注

$[Footnotes]

参考文献

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