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世界华人消化杂志. 2003-08-15; 11(8): 1248-1250
在线出版日期: 2003-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i8.1248
乙型肝炎病毒Ｘ蛋白反式激活作用的研究
杨倩, 刘妍, 成军, 王建军, 洪源, 张树林
杨倩, 刘妍, 成军, 王建军, 洪源, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
张树林, 西安交通大学第一医院传染科 陕西省西安市 710061
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-03-08
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15

N/A

关键词: N/A
引文著录: 杨倩, 刘妍, 成军, 王建军, 洪源, 张树林. 乙型肝炎病毒Ｘ蛋白反式激活作用的研究. 世界华人消化杂志 2003; 11(8): 1248-1250
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: March 8, 2003
Revised: March 20, 2003
Accepted: April 16, 2003
Published online: August 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)是引起急、慢性肝炎的主要原因, 部分HBV感染者还可发展为肝硬化、原发性肝癌[1-3]. HBV是很小的包膜病毒, 病毒基因组结构精密, 约3200个bp(nt), 含4个开放读码框架, X基因为最小的一个, 位于1374-1838 nt, 编码一个Mr为16-17 kD的145-154个氨基酸残基(aa)多肽. HBxAg蛋白在病毒复制、肝细胞癌变方面具有十分重要的作用, 可反式激活病毒和细胞启动子进而调节病毒及细胞的转录, 亦可调节细胞癌基因的表达和改变细胞的生长特性[4-7]. HBxAg蛋白的奇特之处在于: 结构简单, 但却具有广泛的反式激活作用. 目前对HBxAg蛋白反式激活作用途径研究的较为广泛, 就这方面的研究作一概述.

1 HBxAg蛋白与HBV复制

HBxAg蛋白可反式激活广泛的启动子, 包括HBV基因组, 为比较反式激活效率和了解启动子特异的空间结构是否影响转录活性, Nakatake et al [8]利用氯霉素乙酰化酶( CAT)报告基因构建了8个载体质粒, 其中４个质粒含有相应的４个单独HBV启动子, 而另外４个质粒, CAT分别被插入HBV基因组4个启动子的下游, 每一个载体质粒与表达质粒pRSV-X共转染人肝癌细胞株HepG2, 发现所有这些启动子均能被X蛋白增强2-3.5倍. Ｘ基因框内起始密码子变异分析表明内部翻译的启动导致反式激活产物的产生, Ｘ基因终止密码子变异的HBV基因组转染HepG2后, 病毒的复制水平下降; 当与野生型Ｘ基因共转染时, 病毒的复制水平将会得到恢复. Renner et al [9]用含HBV增强子、C区启动子及CAT报告基因的质粒与X基因重组表达质粒共转染肝癌细胞PLC/PRF/5, 同样也发现X基因可反式激活HBV增强子.

2 HBxAg蛋白在细胞中的反式激活作用

HBV是原发性肝癌主要危险相关因素之一, 瞬时转染实验表明HBxAg蛋白具有广泛激活作用, 影响细胞转录、生长以及细胞凋亡[10-13]. 虽然不能与DNA结合[14], 但HBxAg蛋白能激活多种顺式作用元件, 如: AP-1、AP-2、NF-κB、CRE[15-17]. 目前认为HBxAg蛋白广泛的激活作用是由于其具有双重作用途径. HBxAg蛋白在细胞内定位于细胞质和核内[18], 对HBxAg反式激活的途径目前研究认为存在两种方式, 即: 在胞质中通过信号传导途径, 如: Ras-Raf-MAPK级连反应调节基因的表达; 在核内与TATA结合蛋白等相互作用而影响基因的表达. Klein et al [19]报道HBxAg蛋白能直接激活Src酪氨酸蛋白激酶的活性. 如将Src酪氨酸蛋白激酶抑制因子CSK与HBxAg一起导入细胞内, 则激活作用消失. Src激酶被激活后能刺激Ras-Raf-ＭAKP传导通路, 促进c-Fos和c-Jun的合成, c-Fos和c-Jun以异二聚体的方式组成了AP-1, AP-1直接结合序列特异的AP-1启动子上游反应元件, 使转录水平上调. Heissmeyer et al [20]报道HBxAg可以激活转录因子NF-κB, 主要是通过两种不同的胞质传导方式: 作用于37 kD的I κα阻止因子和105 kD的NF-κB前体阻止蛋白. HBxAg诱导I κα阻止因子磷酸化, 可使其活性下降3-4倍; 同时HBxAg介导NF-κB前体阻止蛋白水平下降, 释放RelA蛋白, 进而发生NF-κB的激活. Benn et al [21]发现HBxAg蛋白可明显升高GTP-Ras水平, 激活并使Raf磷酸化, 使ＭAPK酪氨酸磷酸化, 阻断Ras, Raf活性时, 由HBxAg蛋白激发的转录因子AP-1的反式激活功能即被阻止. 对NIH 3T3研究发现多重Ras-Raf-MAPK的激活与细胞转变有关[22]. HBxAg蛋白能够诱导细胞发生转化, 不仅与激活Ras-Raf-MAPK级连反应, 促进细胞进入Ｓ期有关, 而且与HBxAg蛋白对JNK途径的激活有关. JNK途径的激活与细胞转化和凋亡均有关系[23]. 为了解HBxAg蛋白激活作用, Tarn et al [24]建立了两个表达HBxAg蛋白永生化肝细胞系AML12, 即: 高分化的3pX-1和低分化的4pX-1细胞系, 同时证明在3pX-1中HBxAg蛋白可以诱导细胞发生转变, 但在4pX-1细胞却没有同样的现象发生. 即: 发生转变的3pX-1中, HBxAg蛋白可诱导IEGs, ATF3, c-fos的表达, 但在无细胞转化的4pX-1中, 仅有c-fos低度表达. 从HBxAg蛋白在细胞合成开始, 采用动态生化检测评估HBxAg蛋白对促有丝分裂原的激活作用, 发现在HBxAg蛋白表达的最初15 h内, 3pX-1和4pX-1细胞中HBxAg蛋白可产生不同的促有丝分裂原效应. 在3pX-1细胞中, HBxAg蛋白介导持续的ERK1、2激活, 而在4pX-1细胞中HBxAg蛋白只表现出瞬时的ERK1、2激活和持续的JNK激活. 在信号传导通路反式报告检测、动态分析CERB和c-Jun磷酸化作用中, 发现在3pX-1细胞中HBxAg蛋白通过Ras-Raf-MAPK诱导Elk-1和 CREB激活, 在4pX-1细中, HBxAg蛋白选择性激活JNK通路, 进一步支持了HBxAg蛋白在不同的细胞状态下, 可通过不同的信号传导通路介导基因的表达. 胰岛素样生长因子II(insulin-like growth factor-II, IGF-II)与原发性肝癌的形成关系密切. 临床资料显示, 在HBV引起的的慢性肝炎、肝纤维化、肝癌中HBxAg的表达与IGF-II升高相关, IGF-II基因的４个启动子中, 启动子２、3、4被激活[25]. Lee et al [26]研究发现HBxAg蛋白能够提高IGF-II基因启动子3、4诱导的IGF-II的表达, 进一步研究发现HBxAg蛋白可以正向调节启动子４的转录活性, 其中Sp1结合位点与这种转录激活密切相关. GAL4-Sp1融合蛋白实验证明HBxAg蛋白确可以提高体内IGF-II的表达水平, HBxAg蛋白不能与Sp1直接结合, 但是HBxAg蛋白可以增加磷酸化的Sp1对DNA的亲和性, 而变异的HBxAg蛋白失去这种激活作用. Kang-Park et al [27]报道由HBxAg蛋白介导的Sp1诱导的IGF-II P4转录激活, 与PKC和p44/p42MAPK信号传导途径有关, 因为: (1)在HBxAg转染的HepG2细胞中, PKC的激活和表达载体都能提高Sp1的磷酸化和P4的活性, (2)在相同的细胞中, PKC被Go6976阻止后, Sp1磷酸化和P4的活性以及IGF-II mRNA水平均下降; (3)MEK的激活被阻止后也产生同样的结果. Anand et al [28]发现HBxAg蛋白能缩短细胞从Ｇ0期进入S期的时间, 促进G0/G1和Ｇ1/M期之间的转化, 这种作用与提高CDK2和CDC2蛋白激酶水平有关, 而这两种激酶主要激活细胞周期蛋白A、E、B. 进一步研究显示HBxAg通过激活ras和一个未知因子促进细胞增生, 未知因子可进一步激活JNK.

除了通过信号传导途径影响细胞基因的表达外, 位于核内的HBxAg蛋白还可以直接通过蛋白-蛋白相互作用对基因的表达产生反式激活作用. 一些研究发现很多转录因子能够与HBxAg蛋白相结合, 如: TATA结合蛋白(TBP), RNA聚合酶亚单位5(RPB5), oct-1, p53[29]; 体外实验发现HBxAg蛋白在细胞提取物中可以激活转录[30]; 将HBxAg 与LexA或c/EBP DNA结合域融合表达时, 顺式表达元件可以被激活[31]. Fischer et al [32]利用酵母双杂交技术发现HBxAg能够与蛋白酶体α亚单位结合, HBxAg蛋白128位的变异将会取消这种结合作用. Lin et al [33]运用Western blotting、GST-树脂结合试验和免疫共沉淀在体内和体外均证实转录因子(transactivation factor, TF)TFIIB、RPB5、HBxAg可以相互作用. 而且每一个蛋白都有与其他二者结合的区域, 三者之间形成一个三聚体复合物. HBxAg的转录激活作用需要这种复合物的形成, 当HBxAg发生变异时, 对TFIIB或RPB5结合力下降, HBxAg蛋白的反式转录激活能力也明显下降. TFIIB结构较为保守, 与RNA聚合酶结合后, TFIIB能够决定转录起始位点. 激活后的TFIIB能够与不同的基因特异性转录调节蛋白相结合, 如: TFIID、TFIIF等. TFIIB可能是HBxAg作用的靶蛋白. HBxAg与TFIIB两个直接重复区结合, HBxAg蛋白通过这种结合诱导TFIIB空间构象变化调节TFIIB的功能. 含锌指结构的TFIIB Ｎ-末端是RPB5和RNA聚合酶(RNAP)结合部位. 因此, Lin et al [34]认为HBxAg反式激活的方式可能存在两种形式. 一种方式是在TFIIＡ存在的情况下TFIID首先与启动子结合形成TFIID－启动子复合物, 该复合物被TFIIB识别. TFIIB作为一个桥梁进而连接RNAPII/TFIIF, HBxAg同时与RPB5和TFIIB结合后可以促进RNAPII/TFIIF与启动子的结合, 或使RNAPII/TFII－启动子结构稳定. 另外一种方式是含有RNAPII和激活因子如TFIIF、TFIIB、TFIIH的RNA聚合全酶直接与启动子结合, HBxAg通过与TFIIB和RPB5结合促使全酶的结合或使其更加结构稳定.

HBxAg蛋白细胞同时定位于胞质、胞核及其两种相对独立的反式激活途径, 使其在HBV感染、HBV相关肝癌的发生和发展方面处于十分重要的地位, 对其反式激活途径、方式进行深入的研究, 有助于了解HCC发病机制, 并对相应的治疗提供新的方法.

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