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世界华人消化杂志. 2003-08-15; 11(8): 1240-1242
在线出版日期: 2003-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i8.1240
乙型肝炎病毒X基因启动子结构及调节研究
邵清, 成军, 白雪帆
邵清, 成军, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
白雪帆, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院感染科 陕西省西安市 710038
基金项目: 国家自然科学基金项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-03-08
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15

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关键词: N/A
引文著录: 邵清, 成军, 白雪帆. 乙型肝炎病毒X基因启动子结构及调节研究. 世界华人消化杂志 2003; 11(8): 1240-1242
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: March 8, 2003
Revised: March 20, 2003
Accepted: April 16, 2003
Published online: August 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)持续感染导致全球性健康问题, 目前全世界有3.5亿人感染HBV, 约占全部人口的6%. 其中相当一部分感染者发展为慢性肝炎, 少数还发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC), 至今仍缺乏有效控制[1-4]. 造成这一局面的原因多种多样, 其中关于HBV与肝细胞之间相互作用的分子生物学机制的研究进展相对滞后是严重影响新型治疗技术和新型药物开发与研究的重要原因之一. 进一步弄清HBV DNA的复制、转录及调节的过程, 对于我们研究乙型肝炎的发病机制具有重要促进作用. 既往研究关于HBxAg蛋白和X基因较多, 对于X启动子的研究较少, 本文仅就乙型肝炎病毒X基因启动子结构及调节近几年的研究进展作一综述.

1 乙型肝炎病毒基因组结构

HBV是很小的包膜病毒. HBV DNA和HBV聚合酶由核壳包裹成为核心颗粒, 再由含HBsAg的脂蛋白包裹. 病毒基因组是部分双链DNA结构. 双链的长度不等, 负链与病毒的mRNA互补, 较短的链为正链. HBV基因组结构精密, 仅约3200个bp(3182-3221 nt, 3.2 kb), 但可以最小容量发挥高效功能. HBV负链核苷酸序列至少有4个开放读框(open reading frame, ORF): C、P、S基因(相当于逆转录病毒的gag、pol和env基因)分别编码核壳、聚合酶和外膜蛋白; 另一ORF因开始鉴定时对其基因产物的功能不明确而称X. 正链序列上似无保守序列. 由双链DNA转录为RNA, 是一个需要高度调节的过程. 因而病毒基因组不仅含有编码蛋白的结构基因, 也有调节元件(regulatory element). 作为调节元件的一段DNA序列, 可与某些细胞蛋白或病毒蛋白结合, 正性或负性调节转录. 分散在整个HBV基因组中有多个调节元件, 包括４种启动子、２种增强子、包装信号、ε糖皮质激素应答元件等[5]. HBV基因组分为结构基因序列和调节基因序列两大部分. 调节基因序列和结构基因序列相互重叠, 即使结构基因序列本身也有部分重叠, 因此, HBV具有结构紧密的特点. HBV序列是在C、SI、SII和X启动子控制下转录的. 除了表面抗原基因启动子I(SPI), 所有其他启动子均缺乏TATA盒.

2 X基因启动子结构及调节

X-ORF在1 374-1 837 nt之间. adr 亚型有27 bp的缩短, 其基因产物反式激活增强子和启动子的转录功能[6]. X基因启动子(Xp)在1 235-1 374 nt区段, 调节转录0.8的mRNA, 无TATA盒, 有不同的5'-端. Xp的组织特异性不如Cp和Sp的严格, 可在肝细胞以外的组织中起转录调节作用. X启动子调节编码HBxAg的0.9 kb mRNA转录[6]. 这个可调节的转录位于转录开始位点前140 nt. 并且这个最小的启动子与3'-末端的增强子Ⅰ成分相重叠, 由20 nt组成[7,8]. 这个最小的启动子象大多数HBV启动子一样与增强子I的转录是分开的, 他缺乏通常的TATA-盒或GC丰富的序列结构[9]. 但是, X启动子包含了广泛结合的位点和肝特异性转录因子, 如调节作用蛋白X启动子结合蛋白(X-PBP)[10] 结合位点. HBxAg表达具有调节作用的转录包含顺式相互作用位点, 能与转录因子NF1、C/EBP、ATF 和AP1/Jun-Fos结合. 而且肿瘤抑制基因产物p53可与之结合并抑制启动子功能[11].

Zhang et al [7]用瞬时转染分析的方法在不同的细胞系Huh7、Hep3B、PLC/PRF/5、HepG2, 从去甲基化的肝细胞瘤细胞系 HepG2.1和HeLa S3中测定了增强子I对X启动子的作用, 在不同的肝细胞瘤系和HeLa S3细胞系, 组合在HBV 1071 nt(-239)和1238 nt (-72)的增强子I可提高组合在1239 nt (-71)和1376 nt (+67)的X启动子超过30倍, 在去甲基化肝细胞瘤细胞系HepG2.1中大约为10倍, 在不同的肝细胞瘤细胞系中组合于1117 nt (-193)和 1204 (-106)增强子I亚种对于增强子I的功能是很重要的, 同时在所实验细胞系中组合于1222 nt (-88)和1238 nt (-72)的增强子I亚种需要增强子活性. 在所有的细胞系中最小的X启动子成分组合于1222 nt (-88)和1238 nt (-72)之间的138 nt. 从X启动子开始的转录水平是细胞类型特殊机制.

Treinin et al [8]将一系列的X基因上游质粒连接CAT基因, 转染细胞中标记的CAT基因表达实验证明X基因前序列中包含1个活动的启动子. 用引物延伸描绘RNA证明编码RNA是由X基因启动子起始的, 在乙肝病毒基因组1 250-1 350 nt的多个位点. HBV增强子成分区域的缺失使X基因启动子活性下降, 提示X基因启动子需要增强子成分以达到最大活性.

Takada et al [10]测定了一个HBV X基因20 bp的启动子序列, 并发现1个他的结合蛋白, 然后用瞬时表达技术测定从这20 bp启动成分开始的X基因转录受HBxAg蛋白和p53肿瘤抑制基因产物的影响程度. X蛋白表达可促进X基因启动子的活性, 正常p53转染可抑制其活性. 另一方面, p53基因突变体产物无抑制作用, 甚至p53对X基因转录的抑制作用由于X蛋白的共同表达而消失. 没有结合X-PBP的启动子仍对X蛋白和p53有应答, 提示X蛋白反式激活和p53抑制作用不依赖于X-PBP与启动子成分的结合. 实验数据提示在X基因转染的细胞中, X蛋白可使正常p53蛋白结构破裂.

Nakamura et al [11]用迁移率移动和胰脱氧核糖核酸酶印迹实验的方法鉴定出一种蛋白, 用氯霉素乙酰化酶(CAT)测定实验证实这个具有启动子活性的16 bp (1102-1117 nt) 的结合位点在X基因中. 包含此结合位点的58 bp (1085-1142 nt) DNA片段可被HBV增强子增强. 用此58 bp的DNA片段作迁移率移动实验探针, 实验显示1105-1112 nt 之间的回文结构被破坏后, 其丧失结合活性, 启动子活性也显著下降. 结合位点与已知的转录因子靶序列均不同. 因此认定此因子为HBV X基因启动子结合蛋白. 经同源性搜索, 此结合位点与人层粘连蛋白受体启动子成分和脂蛋白受体相关蛋白(LRP)基因有高度的同源性.

Yaginuma et al [12]用人肝细胞瘤细胞系(HuH-7)发现一种序列特殊的细胞因子, 与X开放读框上游第1个ATG(1 248 nt)的启动子区域结合. 胰脱氧核糖核酸酶Ι印迹分析实验显示结合序列位于1097-1119 nt, 内有一个８bp的回文结构. X基因转录子S1核酸酶分析证实结合位点靠近X mRNA的两个主要起始位点1117 nt和1125 nt. 并进一步证明, 在结合位点导入一个突变可在8 bp回文结构以外引起X mRNA转录起始端结合功能丧失的伴随变化. 当X mRNA翻译成X蛋白的时候这个启动子结合蛋白似乎支配X启动子.

Guo et al [13]报告HBV增强子I增强子元件与X基因启动子重叠, 经甲基化干扰实验发现4个集簇在1个120 bp区域的蛋白因子结合位点, 用来控制X启动子活性和增强子I能力. 缺失定位实验显示2个上游的蛋白因子结合位点构成一个基础增强模块, 此模块可被一个肝特异性因子和一个非特异性因子控制. 可被单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因启动子激活5-10倍, 定向依赖于一个肝来源细胞系(Huh7), 在其他试验的细胞类型没有发现. 2个下游蛋白因子结合位点与上游基础增强模块相互作用, 通过定向和距离依赖机制可另增大增强子活性10倍. 除此之外, 2个下游蛋白因子结合位点中至少有一个是X启动子活性所必需的.

Gustin et al [14]用接头分区诱变实验和删除分析实验联合确定HBV增强子I-X启动子(1042-1354 nt, HBV adw2)表达单一蛋白结合位点的机制. 在HuH7细胞EF-C位点接头分区诱变实验中X启动子活性下降67.5%, 但在HepG2和HepSK中没有作用. 在HuH7、HepG2和HepSK细胞中 E成分突变导致X启动子大约下降50%. 删除分析实验显示EF-C位点(mp1163)需要X启动子全部活性, 涉及NF-1a位点时需足够的X启动子基础活性. NF-1a位点的PCR定向接头分区诱变实验中并没有使启动子活性下降, 提示此位点并不是启动子必需成分. 增强子I复杂甚至部分重复的蛋白质DNA相互作用对于全部X启动子活性是必需的. 必需的基础启动子成分的缺乏提示2个分离的HBV增强子成分是由基因整合作用生成一个原始的增强子成分.

Xu et al [15]将HBV质粒同p73α和 p73 β表达载体共转染进HepG2细胞, 表面抗原和e抗原用ELISA检测, 病毒转录合成用Northern blotting评价. HBV调控元件增强子I/X启动子活性用萤虫素酶测定来评价. 结果显示p73α和 p73 β通过下调增强子I/X启动子活性来抑制表面抗原和e抗原表达, 但p73 β比p73α作用更强. p73α和 p73 β均为p53家族成员.

Choi et al [16]将激活转录因子2 (ATF2)表达载体与连接了CAT的X启动子质粒共转染进HepG2细胞, 结果抑制了X启动子活性. 通过HBV E成分, 活化的激活蛋白1 (AP1)介导HBx转录高达35倍, 当ATF2存在时其激活活性被抑制, 提示X启动子自活化的作用被ATF2所抑制. AP1介导的基础转录和HBx 造成X启动子自活化. 在HBV E成分中由于AP1和ATF2 结合位点是重叠的, ATF2对X启动子活性的抑制作用与AP1结合位点是竞争的, 并且形成ATF2-Jun异二聚体与AP1成分是一致的. X小启动子有1个ATF2结合位点, 并可被ATF2激活. ATF2对X蛋白有综合调节作用.

Chol et al [17]用5'串行缺失分析的方法对X小启动子进行研究, X小启动子位于X-ORF中间的5'-端, 实验发现了1个X小启动子的阳性调节序列, 2个细胞的蛋白p110和p33分别约束此调节序列的3'端-和5'-端. p33和p110分别的结合位点缺失突变分别导致阳性成分活性的下降和升高, 因此对p33的功能而言, p33具有反式激活作用, p110具有抑制作用. P110体外磷酸化减少了他的靶DNA结合能力可进一步证明这一点.

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