基础研究 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-08-15; 11(8): 1156-1159
在线出版日期: 2003-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i8.1156
苦参碱对大鼠原位肝移植冷缺血再灌注中肝窦内皮细胞损伤的影响
仇毓东, 朱新华, 史敏科, 丁义涛
仇毓东, 朱新华, 史敏科, 丁义涛, 南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科 江苏省南京市 210008
仇毓东, 男, 1967-05-10生, 江苏人, 汉族, 2000-07第二军医大学博士研究生毕业, 副主任医师, 副教授, 主要从事肝脏移植及原发性肝癌的临床和基础研究工作.
基金项目: 江苏省中医药管理局资助项目, No. SZ 9902.
通讯作者: 仇毓东, 210008, 江苏省南京市, 南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科. yudongqiu510@hotmail.com
电话: 025-3304616-11601 传真: 025-3317016
收稿日期: 2002-12-10
修回日期: 2002-12-30
接受日期: 2003-01-08
在线出版日期: 2003-08-15

目的

探讨苦参碱对大鼠原位肝移植冷缺血再灌注中肝窦内皮细胞损伤的保护作用及其机制

方法

本实验采用大鼠原位肝移植模型, 供肝保存5 h, 224只大鼠随机分为对照组、小剂量治疗组、大剂量治疗组和假手术组, 分别检测移植术后1、2、4 h血透明质酸(hylluronic acid, HA)及肝组织细胞间黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)的含量, 并观察肝血窦内皮细胞形态学、肝功能及各组大鼠术后1 wk生存率的改变.

结果

与对照组比较, 两治疗组术后各时点的透明质酸和细胞间黏附分子-1表达均显著降低, 肝血窦内皮细胞形态也发生改善, 且两治疗组大鼠术后肝功能和1 wk生存率显著提高, 而两治疗组间各指标比较均无显著差异.

结论

苦参碱对大鼠原位肝移植冷缺血再灌注中肝血窦内皮细胞损伤具有保护作用.

关键词: N/A
引文著录: 仇毓东, 朱新华, 史敏科, 丁义涛. 苦参碱对大鼠原位肝移植冷缺血再灌注中肝窦内皮细胞损伤的影响. 世界华人消化杂志 2003; 11(8): 1156-1159
Protective effect of matrine on sinusoidal endothelial cells of rat liver isograft
Yu-Dong Qiu, Xin-Hua Zhu, Ming-Ke Shi, Yi-Tao Ding
Yu-Dong Qiu, Xin-Hua Zhu, Ming-Ke Shi, Yi-Tao Ding, Department of Hepatobiliary Surgery, Affiliated Drum Tower Hospital, Medical School of Nanjing University, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China.
Supported by: the Traditional Chinese Medicine Administration Bureau of Jiangsu Province, No. SZ 9902.
Correspondence to: Dr. Yu-Dong Qiu, Department of Hepatobiliary Surgery, Affiliated Drum Tower Hospital, Medical School of Nanjing University, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China. yudongqiu510@hotmail.com
Received: December 10, 2002
Revised: December 30, 2002
Accepted: January 8, 2003
Published online: August 15, 2003

AIM

To investigate the protection effect of matrine on cold ischemia and reperfusion injury of sinusoidal endothelial cells (SEC) of liver isograft.

METHODS

Two hundred and twenty-four SD rats were randomly divided into four groups: untreated group, low-dose treated group, high-dose treated group and sham operation group. After 5 hours of cold preservation with Ringer's solution, orthotopic liver transplantation was performed. At 1 h, 2 h and 4 h time-points after reperfusion, 6 rats were killed in each group to collect the serum sample and the middle lobe of liver for detection, and the other 8 rats were raised to study the one week survival rate post-transplantation.

RESULTS

All recipients in control group died within 48 hours, mostly between 10 to 20 hours, and matrine treatment increased one week survival rate to 75% in both treated groups. The level of Hylluronic Acid (HA) and glutamate pyruvate transaminase (ALT) decreased significantly with matrine treatment. And the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) decreased significantly in both treated groups, and the pathological changes of SEC ameliorated.

CONCLUSION

Matrine can prevent SEC from cold ischemia and reperfusion injury in rat orthotopic liver transplantation.

Key Words: N/A
0 引言

移植肝脏冷保存再灌注损伤与原发性移植肝无功能密切相关[1], 但其具体作用机制尚未明确, 仍是当前临床肝移植工作中亟待解决的难题. 冷保存再灌注损伤可以导致肝窦内皮细胞变圆、脱落至肝窦腔内[2], 研究结果表明肝窦内皮细胞损伤程度与移植肝功能有关[3]. 目前, 人们普遍认为由氧自由基[4]、枯否细胞激活[5]或肝窦内炎性细胞聚集[6]所介导的肝窦内皮细胞损伤和/或肝窦微循环障碍[7]是冷保存相关的移植物功能丧失的主要原因.

苦参碱为中药苦参提取的有效成分, 其基本结构为苦参次碱-15酮, 具有抗炎抗氧化[8]、免疫抑制[9]、保肝[10]等作用, 临床已广泛用于慢性肝病的治疗. 药理学研究尚未发现苦参碱有明显的毒副作用[11]. 苦参碱能显著抑制枯否氏细胞激活, 降低血中肿瘤坏死因子和白介素-6水平[8], 这就表明苦参碱有可能对移植肝脏再灌注损伤有保护作用. 因此, 本实验采用大鼠原位肝移植模型, 研究苦参碱对供肝冷保存再灌注中肝窦内皮细胞损伤的保护作用.

1 材料和方法
1.1 材料

♂健康SD大鼠224只(购自南京军区总医院动物中心), 质量200-220 g, 随机分为对照组、小剂量治疗组、大剂量治疗组和假手术组. 各组有大鼠32对(只). 大鼠原位肝移植模型参照改良Kamada法[12]进行. 各组供肝取出后均置于4 °C林格氏液中保存5 h再植入受体. 受体门静脉阻断时间不超过20 min. 小剂量治疗组受体术前30 min腹腔注射苦参碱(购自广州明兴制药厂) 40 mg/kg; 大剂量治疗组术前30 min腹腔注射苦参碱80 mg/kg; 对照组同法注入生理盐水1 mL; 假手术组方法同肝移植受体的肝脏游离, 只是不作肝切除, 目的是进行正常对照, 以排除手术因素或肝动脉结扎对实验的影响. 各组大鼠于再灌注后1、2、4和24 h分别取6只经下腔静脉取血4 mL, 离心(4 °C, 3 000 r/min) 10 min后, 取上清置于-70 °C冰箱保存待测. 同时分别取肝中叶组织适量快速置于液氮中保存待测.

1.2 方法

各组分别取8只受体大鼠进行饲养, 观察1 wk存活率. 取各组大鼠再灌注后4和24 h血清, 采用全自动生化分析仪测定谷丙转氨酶(ALT). 取各组大鼠再灌注后1、2和4 h血清, 采用透明质酸放射免疫分析测定盒(购于上海海洋医学生物技术中心)测定血清透明质酸(HA)浓度. 再灌注后1 h、2 h和4 h分别处死大鼠后取肝中叶组织, OCT胶包埋后, 液氮冻存. 冰冻切片4-8 μm, 室温放置30 min后, 入4 °C丙酮固定10 min, PBS洗, 5 min×3次, 30 mL/L过氧化氢孵育6 min后, PBS洗, 5 min×2次, 下接常规免疫组化染色操作步骤. 一抗采用Mouse-anti-rat CD54 (ICAM-1)单克隆抗体, MCA773(购自英国Serotec公司), 稀释度为1:50. 检测肝组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达. 再灌注后4 h处死大鼠, 各取前叶肝组织经中性甲醛固定、石蜡包埋后切成4 μm薄片, HE染色, 光镜下观察肝脏组织的病理形态学变化. 再灌注后4 h处死大鼠, 各取前叶1-2 mm见方肝组织放入4°C 20 g/L戊二醛液中固定, 经锇酸后固定, 乙醇脱水, 环氧树脂Epon 618包埋, 用AO-E型超薄切片机超薄切片, 铅铀双染, 在JEM-1200EX型透射电镜下观察.

统计学处理 所有数据以mean±SD表示, 采用SAS软件方差分析snk (student-newman-keuls)法进行统计分析.

2 结果

大鼠原位肝移植手术成功率约为95%, 但对照组8只大鼠都于术后48 h内死亡, 而两苦参碱治疗组大鼠术后的1 wk存活率均达到75%. 与假手术组比较, 治疗组和对照组移植术后ALT值均升高. 两治疗组术后4和24 h的ALT值均显著低于对照组(P<0.01, 图1), 且两治疗组间术后4和24 h 的ALT值也有显著差异(分别为P<0.05和P<0.01).

图1
图1 大鼠原位肝移植术后血清ALT水平. aP<0.05, bP<0.01, vs 对照组; cP<0.05, dP<0.01, vs 小剂量治疗组.
2.1血清透明质酸

与假手术组比较, 治疗组和对照组移植术后各时间点HA值均升高, 且术后HA的高峰均出现在术后2 h. 两治疗组术后各时间点HA值均显著低于对照组(P<0.01, 图2), 且两治疗组间术后各时间点HA值也有显著差异(分别为P<0.05和P<0.01).

图2
图2 大鼠原位肝移植术后血清HA水平. aP<0.05, bP<0.01, vs 对照组; cP<0.05, dP<0.01, vs小剂量治疗组.
2.2 肝组织ICAM-1的表达

对照组术后1 h即可在肝窦内皮细胞表面、部分肝细胞及肝血窦内出现ICAM-1的表达, 至术后2和4 h更可见ICAM-1的强表达(图3). 两治疗组术后各时间点也出现了ICAM-1的表达, 但其表达均明显减弱, 且两组间表达程度未见明显差异(图4).

图3
图3 对照组大鼠术后2 h SEC表面、部分肝细胞和肝血窦内出现ICAM-1强表达 ×200.
图4
图4 小剂量苦参碱治疗组大鼠术后2 h ICAM-1表达明显减弱×200.
2.3 肝组织病理学改变

与假手术组比较, 对照组和治疗组均可见肝血窦腔内淤血及炎性细胞浸润, 但对照组最严重, 两治疗组明显减轻; 对照组和治疗组均可见变圆、脱落至肝血窦腔内的内皮细胞, 其中对照组明显多于两治疗组(图5). 两治疗组肝窦内皮细胞形态学改变无明显差异(图6).

图5
图5 对照组大鼠术后4 h肝窦内淤血、炎性细胞浸润及SEC肿胀脱落 HE×200.
图6
图6 小剂量苦参碱治疗组大鼠术后4 h SEC基本恢复正常 HE×200.
2.4 肝血窦超微结构观察

假手术组大多数SEC形态和结构基本正常, 未见明显肿胀及凋亡细胞. 对照组 SEC明显肿胀, 核膜不规整, 可见核固缩、聚集、着边的凋亡SEC, 线粒体水肿、部分空泡化, 粗面内质网扩张, 可见髓鞘样结构. 包膜部分断裂, 失去胞突, 内皮细胞向血窦腔内突出, 并可脱落入肝血窦腔内. 血窦腔内可见大量中性粒细胞、淋巴细胞等浸润(图7). 小剂量治疗组SEC核膜稍显不规整, 伸展部变薄, 但覆盖完整. 内皮细胞轻度水肿, 溶酶体增多, 粗面内质网无扩张, 吞饮小泡丰富, SEC损伤明显减轻. 血窦腔内细胞浸润的程度和范围也明显轻于对照组(图8). 大剂量治疗组SEC损伤仍存在, 其超微结构改变与小剂量治疗组类似.

图7
图7 对照组大鼠术后4 h SEC EM×12000.
图8
图8 小剂量苦参碱治疗组大鼠术后4 h EM×6000.
3 讨论

有关肝移植冷缺血再灌注损伤机制的研究很多, 其中微循环再灌流障碍日益受到重视. 其发生的主要原因有: (1)肝血窦内皮细胞对冷热缺血均比肝细胞敏感, 早期即可能出现不可逆损伤, 同样, 在再灌注期内皮细胞比肝细胞早发生致死性损伤, 再灌注后内皮细胞出现肿胀、死亡及脱落, 阻塞血窦[13] ; (2)再灌注后粒细胞黏附、聚积及毒性作用[14]; (3)血小板激活因子大量生成[15], 内皮细胞脱落后其下组织暴露引起血小板黏附, 血管内凝血, 产生血栓; (4)内皮素大量生成[16], 而NO产生减少, 使SEC收缩, 循环阻力增加. 本实验结果提示, 肝血窦内皮细胞损伤及顺应性改变可致肝血窦阻塞, 再灌注障碍, 从而使肝组织细胞仍处于缺血状态, 损伤进一步加重发展.因此, 在肝移植缺血再灌注损伤过程中, 保护内皮细胞和保护肝细胞同样重要, 这对于防止移植肝脏微循环障碍, 术后发生"无复流"等现象, 最终导致原发性移植肝无功能具有重要临床意义. 由于供肝保存在4 °C林格液中的安全时限为2-4 h[17], 为探讨苦参碱对肝窦内皮细胞冷缺血再灌注损伤是否有保护作用, 我们在实验中采用将供肝于移植术前置于4 °C平衡液中保存5 h, 再移植入受体的大鼠原位肝移植模型. 实验结果表明苦参碱对移植肝脏有明显的保护作用, 能显著的改善大鼠肝功能和移植术后1 wk存活率.

SEC上有HA特异性的受体, 可通过胞吞方式摄取和降解HA. 故当SEC损伤时, 其对内源性HA摄取量降低, 血清HA浓度也就相应上升. 实验结果表明两苦参碱治疗组术后各时间点的HA浓度都显著低于对照组, 但是增加苦参碱剂量并不能增强其对SEC的保护作用, 这与张俊平et al [18]的研究结果一致. 苦参碱对移植肝脏保存再灌注损伤的保护作用机制目前尚未明确. 最近移植肝脏微循环再灌流障碍日益受到重视. 肝脏缺血再灌注后, 枯否细胞激活并且释放肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α等炎性因子[19], 从而激活SEC和肝细胞在其细胞表面表达ICAM-1及释放粒细胞激活因子(例如白介素-1和血小板活化因子等), 从而诱导中性粒细胞表面产生淋巴细胞功能相关性抗原(lymphocyte-function-associated antigen-1, LFA-1)[20]. 这样, 中性粒细胞通过与ICAM-1及白细胞激活因子的黏附, 在肝窦腔内形成聚集, 导致相应部位的微循环障碍. 本实验结果表明苦参碱能显著降低肝窦内皮细胞表面ICAM-1的表达和炎性细胞在肝窦腔内的聚集, 从而减轻再灌注导致的微循环障碍. 此外, 多项研究均表明苦参碱能有效抑制枯否细胞激活及释放TNF-α、白介素-1(interleukin-1, IL-1)和白介素-6(interleukin-6, IL-6)等炎性因子[18,21].

苦参碱可以通过抑制枯否细胞激活及TNF-α、IL-1、IL-6等炎症性细胞因子的释放, 减少粒细胞与SEC的黏附, 从而减轻SEC的损伤, 改善移植肝脏微循环. 苦参碱作为药物的单体成分, 其化学结构、药代动力学、药效学及药理作用机制明确, 副作用很小, 并已制备出多种剂型供临床选用, 临床应用前景较广泛.

1.  Jaeschke H. Preservation injury: mechanisms, prevention and consequences. J Hepatol. 1996;25:774-780.  [PubMed]  [DOI]
2.  Clavien PA. Sinusoidal endothelial cell injury during hepatic preservation and reperfusion. Hepatology. 1998;28:281-285.  [PubMed]  [DOI]
3.  Schon MR, Kollmar O, Akkoc N, Matthes M, Wolf S, Schrem H, Tominaga M, Keech G, Neuhaus P. Cold ischemia affects sinusoidal endothelial cells while warm ischemia affects hepatocytes in liver transplantation. Transplant Proc. 1998;30:2318-2320.  [PubMed]  [DOI]
4.  Connor HD, Gao W, Nukina S, Lemasters JJ, Mason RP, Thurman RG. Evidence that free radicals are involved in graft failure following orthotopic liver transplantation in the rat-an electron paramagnetic resonance spin trapping study. Transplantation. 1992;54:199-204.  [PubMed]  [DOI]
5.  Brass CA, Roberts TG. Hepatic free radical production after cold storage: Kupffer cell-dependent and -independent mecha-nisms in rats. Gastroenterology. 1995;108:167-1175.  [PubMed]  [DOI]
6.  Clavien PA, Harvey PR, Sanabria JR, Cywes R, Levy GA, Strasberg SM. Lymphocyte adherence in the reperfused rat liver: mechanisms and effects. Hepatology. 1993;17:131-142.  [PubMed]  [DOI]
7.  Imamura H, Brault A, Huet PM. Effects of extended cold preservation and transplantation on the rat liver microcirculation. Hepatology. 1997;25:664-671.  [PubMed]  [DOI]
8.  Lin W, Zhang JP, Hu ZL, Qian DH. Inhibitory effect of matrine on lipopolysacchride-induced tumor necrosis factor and interleukin-6 production from rat Kupffer cells. Yaoxue Xuebao. 1997;32:93-96.  [PubMed]  [DOI]
9.  Liang P, Bo AH, Xue GP, Han R, Li HF, Xu YL. Study on the mechanism of matrine on immune liver injury in rats. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 1999;7:104-108.  [PubMed]  [DOI]
10.  Zhang JP, Zhang M, Zhou JP, Liu FT, Zhou B, Xiu WF, Guo C. Antifibrotic effects of matrine on in vitro and in vivo models of liver fibrosis in rats. Acta Pharmacol Sin. 2001;22:183-186.  [PubMed]  [DOI]
11.  叶 明. 苦参碱注射液的药理研究. 广东医学. 1997;18:793.  [PubMed]  [DOI]
12.  严 以群, 杨 甲梅, 王 轩. 大鼠减体积性肝移植模型. 中华器官移植杂志. 1996;17:55-58.  [PubMed]  [DOI]
13.  Arai S, Mochida S, Ohno A, Ishikawa K, Matsui A, Arai M, Shibuya M, Fujiwara K. Decreased expression of receptors for vascular endothelial growth factor and sinusoidal endothelial cell damage in cold-preserved rat livers. Transplant Proc. 1999;31:2668-2672.  [PubMed]  [DOI]
14.  Shibuya H, Ohkohchi N, Tsukamoto S, Satomis S. Tumor necrosis factor-induced, superoxide-mediated neutrophil accumulation in cold ischemic/reperfused rat liver. Hepatology. 1997;26:113-120.  [PubMed]  [DOI]
15.  Cywes R, Mullen BJ, Stratis MA, Greig PD, Levy GA, Harvey PR, Strasberg SM. Prediction of the outcome of transplantation in man by platelet adherence in donor liver allografts. Evidence of the importance of prepreservation injury. Transplantation. 1993;56:316-323.  [PubMed]  [DOI]
16.  Ishikawa T, Yamamoto Y, Takeuchi K. Relationship between peri and postoperative plasma concentration of endothelin-1 and liver dysfunction in rat liver transplantation. Transplant Proc. 1995;26:524-527.  [PubMed]  [DOI]
17.  Sumimoto R, Jamieson NV, Wake K, Kamada N. 24 -hour rat liver preservation using UW solution and some simplified variants. Transplantation. 1989;48:144-146.  [PubMed]  [DOI]
18.  Zhang JP, Lin W, Hu ZL, Qian DH. Inhibitory effect of matrine on lipopolysacchride-induced tumor necrosis factor and interleukin-6 production from rat Kupffer cells. Acta Pharm Sin. 1997;32:93-96.  [PubMed]  [DOI]
19.  Carrick JB, Martins O Jr, Snider CC, Means ND, Enderson BL, Frame SB, Morris SA, Karlstad MD. The effect of LPS on cytokine synthesis and lung neutrophil influx after hepatic ischemia/reperfusion injury in the rat. J Surg Res. 1997;68:16-23.  [PubMed]  [DOI]
20.  Shirasugi N, Wakabayashi G, Shimazu M, Shito M, Kawachi S, Kitajima M. Interleukin-1 receptor blockade attenuates oxygen-derived free radical production and microcirculatory disturbances in ischemia/reperfusion injury in the liver. Transplantation. 1997;63:143-148.  [PubMed]  [DOI]
21.  Hu ZL, Zhang JP, Wan MB, Yu XB, Lin W, Qian DH. Effect of matrine on mouse hepatitis and tumor necrosis factor production induced by propionibacteriun acnes/lipopolysaccharides. Acta Pharm Sin. 1996;31:662-665.  [PubMed]  [DOI]