病毒性肝炎 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-08-15; 11(8): 1135-1138
在线出版日期: 2003-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i8.1135
丙型肝炎病毒NS5A基因变异与干扰素疗效的关系
张琳, 赵桂珍, 石理兰, 曹丽
张琳, 赵桂珍, 石理兰, 曹丽, 中国医科大学第二临床学院传染科 辽宁省沈阳市 110003
张琳, 女, 1967-06-12生, 辽宁省沈阳市人, 汉族. 1990年大连医学院本科毕业, 1997年中国医科大学硕士研究生毕业, 讲师. 主要从事病毒性肝炎治疗方面的研究.
通讯作者: 张琳, 110003, 辽宁省沈阳市, 中国医科大学第二临床学院传染科. liaiminzhl@163.com
电话: 024-83956981
收稿日期: 2002-11-29
修回日期: 2003-12-20
接受日期: 2002-12-26
在线出版日期: 2003-08-15

目的

探讨HCV1b型慢性丙型肝炎患者HCV NS5A基因变异与干扰素(IFN)疗效的关系, NS5A2209-2248片断是否存在干扰素敏感决定区(ISDR).

方法

留取慢性丙型肝炎患者干扰素治疗前血清, 应用RT-PCR法扩增NS5A基因片段, 用直接测序法进行核苷酸及氨基酸序列测定.

结果

11例HCV1b型患者中1例为中间型, 其余为野生型. 2例表现为完全应答, 均为野生型, 9例为无应答. 两组之间核苷酸及氨基酸序列无显著差异. 对1例患者的动态观察发现, 干扰素治疗后其核苷酸及氨基酸序列均有所变化, 改变了其在基因树中的位置.

结论

HCV1b型NS5A基因变异与干扰素疗效无关, NS5A2209-2248区高度保守. 未证实存在ISDR. 干扰素治疗可引起HCV准种改变.

关键词: N/A
引文著录: 张琳, 赵桂珍, 石理兰, 曹丽. 丙型肝炎病毒NS5A基因变异与干扰素疗效的关系. 世界华人消化杂志 2003; 11(8): 1135-1138
Mutations in nonstructural 5A gene of hepatitis C virus and its response to interferon alfa
Lin Zhang, Gui-Zhen Zhao, Li-Lan Shi, Li Cao
Lin Zhang, Gui-Zhen Zhao, Li-Lan Shi, Li Cao, Department of Infectious Disease, The Second Clinical College, China Medical University, Shenyang 110003, Liaoning Province, China
Correspondence to: Dr. Lin Zhang, Department of Infectious Disease, The Second Clinical College, China Medical University, 36 Sanhao Street, Shenyang 110003, Liaoning Province, China. liaiminzhl@163.com
Received: November 29, 2002
Revised: December 20, 2003
Accepted: December 26, 2002
Published online: August 15, 2003

AIM

To investigate the relationship between NS5A2209-2248 sequences and response to interferon therapy, and whether there is an IFN sensitivity determining region(ISDR) in the region of NS5A2209-2248.

METHODS

We analyzed 11 patients with chronic HCV 1b infection who had received interferon alfa therapy for six months. Pretreatment serum samples were analyzed. The amino acid sequence of NS5A2209-2248 was determined by direct sequencing of the HCV genome amplified by the polymerase chain reaction.

RESULTS

Among the 11 patients, only 1 was intermediate type, all the others were wild type. 2 of wild type patients showed complete response. Others were nonresponders. There was no significant difference in nucleotide and amino acid sequences between the two groups.The nucleotide and amino acid sequences changed after IFN treatment in one nonresponder.

CONCLUSION

The NS5A2209-2248 region was highly conservative. In Chinease patients with chronic HCV 1b infection, there was no correlation between response to interferon and mutations in the NS5A gene. HCV quasispecies changed after IFN therapy.

Key Words: N/A
0 引言

由于HCV基因组具有高度变异性[1-4], 使其感染后极易慢性化[5-8]. 目前丙型肝炎患者临床尚无切实有效的治疗方法, 干扰素仍是唯一可以抑制病毒复制、改善患者生化和组织学指标的药物[9,10]. 但干扰素治疗应答率低、副作用大、费用昂贵, 因此在治疗前进行疗效预测, 成为近年研究的热点. 在影响干扰素疗效的众多因素中, 基因型1b型HCV感染被认为是导致干扰素疗效低下的主要因素[11-14]. 我国大部分患者为此种基因型[15,16]. 但即使均为1b型感染者, 对干扰素治疗的结果可截然不同. 日本学者Enomoto et al发现, 1b型患者HCV NS5A2209-2248区氨基酸序列与干扰素疗效密切相关, 与HCV-J相比, 突变型(氨基酸变异≥4个)对干扰素敏感, 中间型(氨基酸变异1-3个)和野生型不敏感, 因而把NS5A2209-2248区称作干扰素敏感决定区[17-20]. 但在欧美一些国家的研究中, 却未证实ISDR的存在[21-25]. 我们对沈阳地区11例应用干扰素治疗的1b型慢性丙型肝炎患者进行了NS5A2209-2248区核苷酸及氨基酸序列测定, 以进一步探讨NS5A2209-2248基因变异与干扰素疗效的关系.

1 材料和方法
1.1 材料

应用干扰素治疗的慢性丙型肝炎患者共12例, 男8例, 女3例; 年龄23-45岁. 治疗方案为: IFN-α3 MU, 3次/wk, 共24 wk. 疗效判定: 应答组 治疗结束时, ALT正常, HCVRNA阴转, 并持续至6 mo以上. 否则为无应答组.

1.2 方法

HCVRNA提取采用异硫氰酸胍-酚-氯仿提取法. 血清50 μL, 分别加入异硫氰酸胍200 μL, 氯仿/异戊醇50 μL, 振荡混匀, 13000 r/min离心, 10 min, 取水相100 μL, 加等量异丙醇, 混匀, 13000 r/min离心, 10 min, 弃上清, 控干残留液体, 加750 mL/L乙醇200 μL洗涤, 13000 r/min离心, 5 min, 弃上清, 真空抽干, 65 °C 20 min备用. NS5A基因片段扩增采用巢式逆转录聚合酶链反应法. 引物序列: 外引物1:5'-TTGGCCAGCTCTTCAGCTAGC-3'(核苷酸位置6921-6936); 外引物2: 5'-CCAGGACTCTAGCAGTGGAC-3'(核苷酸位置7 211-7 232); 内引物1:5'-TCAGCTAGCCAATTGTCTGC-3'(核苷酸位置6 933-6 952); 内引物2: 5'-CAGTGGAGGGTTGTAGTCTG-3'(核苷酸位置7 200-7 220). 逆转录及第一轮 PCR扩增, 10×buffer 3 μL, dNTP 3 μL, MgCl2 1.56 μL, Taq酶2 U, AMV3U, Rnasin20U, 外引物120 pmol (1 μL), 外引物220 pmol(1 μL), 水19 μL, 总反应体积30 μL. 37 °C 30 min逆转录之后进入PCR扩增, 反应条件为94 °C300 s预变性, 94 °C 45 s, 50 °C 45 s, 72 °C 45s, 共35个循环, 终延伸300 s. 第二轮PCR扩增: 取第一轮扩增产物5 μL, 10×buffer 3 μL, dNTP 3 μL, MgCl2 1.56 μL, Taq酶2U, 内引物120 pmol(1 μL), 内引物220 pmol(1 μL), 水15 μL, 总反应体积30 μL. 反应条件与第一轮相同. 取第二轮PCR产物5 μL进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 片段大小在573 bp左右为阳性结果. NS5A区核苷酸及氨基酸序列测定 采用直接测序法. 由上海联合基因公司完成. 结果应用Biledit软件进行分析. HCV基因分型 采用直接测序法. 依据NS5A区核苷酸序列进行分型.

2 结果
2.1 HCV基因分型

在12例慢性丙型肝炎患者中, 11例为HCV1b型, 1例为HCV1c型, 其中5-1, 5-2, 5-3分别为5号患者治疗前、治疗后3mo, 6moHCV在基因树中的位置(图1).

图1
图1 12例患者的基因分型.
2.2 NS5A2209-2248区核苷酸序列分析

11例1b型患者中3、4号患者为应答者, 余为无应答者, 两组之间核苷酸变异数无显著差异(t = 0.86, P>0.05). 与HCV-J相比, 变异数未超过10%, 且多为同义突变, 表明NS5A区高度保守(表1).

表1 患者NS5A核苷酸序列与HCV-J的比较.
编号核苷酸变异数核苷酸变异率(%)
195.2
2105.8
3105.8
495.2
5137.6
684.7
784.7
8158.8
9116.4
1095.2
1195.2
2.3 NS5A2209-2248区氨基酸序列变异与干扰素疗效的关系

按照Enomoto的分型方法, 11例1b型患者1例为中间型, 余均为野生型, 未见突变型. NS5A2209-2248区氨基酸序列变异与干扰素疗效无关(图2).

图2
图2 NS5A2209-2248区氨基酸序列变异与干扰素疗效关系.
2.4 干扰素治疗对NS5A基因变异的影响

对5号患者的动态观察发现, 干扰素治疗后NS5A基因发生了变异, 导致其在基因树中位置改变(图1中5-1, 5-2, 5-3), 即引起了其准种的改变, 并未导致基因型的变化. 核苷酸变异大多为同义突变. 氨基酸变异情况见图3.

图3
图3 干扰素治疗前后NS5A氨基酸序列变化.
3 讨论

慢性丙型肝炎患者对干扰素治疗的持续应答率(ALT正常HCVRNA阴转持续至治疗结束至少6 mo以上)较低, 仅10-20%[26-28], 而1b型则更低. 如何在治疗前对疗效进行有效的预测, 具有重要的临床意义. 近年在对1b型NS5A2209-2248位氨基酸变异是否与干扰素疗效有关的问题上研究结果不尽一致, 日本学者认为NS5A2209-2248位氨基酸序列可以对干扰素治疗进行疗效预测, 此区域被其称作干扰素敏感决定区(ISDR), 但欧美一些国家的研究却得到相反的结论. 我们的研究结果发现: 11例1b型患者按Enomoto的分型10例为野生型, 1例为中间型, 未见突变型. 2例应答者和9例无应答者之间核苷酸及氨基酸序列无显著差异, 说明NS5A2209-2248位氨基酸变异与干扰素疗效之间无确切关系; 11例患者核苷酸与氨基酸序列同HCV-J[29]相比, 变异较少, 且多为同义突变, 表明NS5A区高度保守, 从另一方面说明以NS5A基因变异来判定与干扰素疗效的关系, 意义不大. Chayama et al [30]也发现: NS5A区很少出现氨基酸替换, 不能对干扰素治疗结果进行预测. 我们的结果与我国学者段学章、唐振亚et al的研究结果相一致[31,32]. 因而, 干扰素敏感决定区可能不适用于中国患者. 应选择其他方法对1b型患者进行干扰素疗效预测.

我们对其中1例无应答者进行了核苷酸及氨基酸序列的动态观察, 发现干扰素治疗后, NS5A区核苷酸及氨基酸序列均发生了变化, 治疗6 mo时病毒在基因树中的位置发生了较明显的改变, 说明干扰素治疗对病毒序列有选择作用, 产生了新的优势株, 即引起了其准种的改变. 这也从一个方面说明了1b型HCV抵抗IFN的机制.

由于本研究病例数较少, 且无突变型患者, 因此不能从另一方面证实突变型对干扰素治疗是否有效. 而Enomoto的报道中, 则有较多的突变型患者, 可能与1b型HCV感染具有地区性特点有关. 导致两种不同研究结果的原因有待进一步研究明确.

1.  Chen S, Wang YM. Genetic evolution of structural region of hepatitis C virus in primary infection. World J Gastroenterol. 2002;8:686-693.  [PubMed]  [DOI]
2.  Zhu LX, Liu J, Li YC, Kong YY, Staib C, Sutter G, Wang Y, Li GD. Full-length core sequence dependent complex-type glycosylation of hepatitis C virus E2 glycoprotein. World J Gastroenterol. 2002;8:499-504.  [PubMed]  [DOI]
3.  Huang F, Zhao GZ, Li Y. HCV genotypes in hepatitis C patients and their clinical significances. World J Gastroenterol. 1999;5:547-549.  [PubMed]  [DOI]
4.  Mullan B, Kenny-Walsh E, Collins JK, Shanahan F, Fanning LJ. Inferred hepatitis C virus quasispecies diversity is influenced by choice of DNA polymerase in reverse transcriptase-polymerase chain reactions. Anal Biochem. 2001;289:137-146.  [PubMed]  [DOI]
5.  Song ZQ, Hao F, Min F, Ma QY, Liu GD. Hepatitis C virus infection of human hepatoma cell line 7721 in vitro. World J Gastroenterol. 2001;7:685-689.  [PubMed]  [DOI]
6.  Ambrosch A, Konig W. Characteristics of the hepatitis C virus and viral predictors of therapeutic response. Med Klin. 1999;94:626-632.  [PubMed]  [DOI]
7.  Meier V, Mihm S, Braun Wietzke P, Ramadori G. HCV-RNA positivity in peripheral blood mononuclear cells of patients with chronic HCV infection: does it really mean viral replication? World J Gastroenterol. 2001;7:228-234.  [PubMed]  [DOI]
8.  Yan FM, Chen AS, Hao F, Zhao XP, Gu CH, Zhao LB, Yang DL, Hao LJ. Hepatitis C virus may infect extrahepatic tissues in patients with hepatitis C. World J Gastroenterol. 2000;6:805-811.  [PubMed]  [DOI]
9.  Gong GZ, Lai LY, Jiang YF, He Y, Su XS. HCV replication in PBMC and its influence on interferon therapy. World J Gastroenterol. 2003;9:291-294.  [PubMed]  [DOI]
10.  Polyak SJ, Gerotto M. The molecular basis for responsiveness to anti-viral therapy in hepatitis C. Forum. 2000;10:46-58.  [PubMed]  [DOI]
11.  Bukh J, Miller RH, Purcell RH. Genetic heterogeneity of the hepatitis C virus. Princess Takamatsu Symp. 1995;25:75-91.  [PubMed]  [DOI]
12.  Hino K, Yamaguchi Y, Fujiwara D, Katoh Y, Korenaga M, Okazaki M, Okuda M, Okita K. Hepatitis C virus quasispecies and response to interferon therapy in patients with chronic hepatitis C: a prospective study. J Viral Hepat. 2000;7:36-42.  [PubMed]  [DOI]
13.  Gitnick G. Hepatitis C: controversies, strategies and challenges. Eur J Surg. 1998;582:65-70.  [PubMed]  [DOI]
14.  Hu KQ, Vierling JM, Redeker AG. Viral, host and interferon-related factors modulating the effect of interferon therapy for hepatitis C virus infection. J Viral Hepat. 2001;8:1-18.  [PubMed]  [DOI]
15.  Wang Y, Okamoto H, Tsuda F, Nagayama R, Tao QM, Mishiro S. Prevalence, genotypes, and an isolate(HC-C2) of hepatitis C virus in Chinese patients with liver disease. J Med Virol. 1993;40:254-260.  [PubMed]  [DOI]
16.  唐 小平, 吴 婉芬, 袁 小珍. 丙型肝炎病毒基因分型及其与疾病程度、感染途径和干扰素疗效的关系. 中华微生物学和免疫学杂志. 1997;2:92-95.  [PubMed]  [DOI]
17.  Enomoto N, Sakuma I, Asahina Y, Kurosaki M, Murakami T, Yamamoto C, Izumi N, Marumo F, Sato C. Comparison of full-length sequences of interferon-sensitive and resistant hepatitis C virus 1b. Sensitivity to interferon is conferred by amino acid substitutions in the NS5A region. J Clin Invest. 1995;96:224-230.  [PubMed]  [DOI]
18.  Enomoto N, Sakuma I, Asahina Y, Kurosakl M, Murakaml T, Yamamoto C, Ogura Y, Izuml N, Marumo F, Sato C. Mutations in the nonstructural protein 5A gene and response to interferon in patients with chronic hepatitis C virus 1b infection. N Eng J Med. 1996;334:77-81.  [PubMed]  [DOI]
19.  Chayama K, Tsubota A, Kobayashi M, Okamoto K, Hashimoto M, Miyano Y, Koike H, Kobayashi M, Koida I, Arase Y. Pretreatment virus load and multiple amino acid substitutions in the interferon sensitivity-determining region predict the outcome of interferon treatment in patients with chronicgenotype 1b hepatitis C virus infection. Hepatology. 1997;25:745-749.  [PubMed]  [DOI]
20.  Murashima S, Ide T, Miyajima I, Kumashiro R, Ueno T, Sakisaka S, Sata M. Mutations in the NS5A gene predict response to interferon therapy in Japanese patients with chronic hepatitis C and cirrhosis. Scand J Infect Dis. 1999;31:27-32.  [PubMed]  [DOI]
21.  Zeuzem S, Lee JH, Roth WK. Mutations in the nonstructural protein 5A gene of European hepatitis C virus isolates and response to interferon alfal. Hepatology. 1997;25:740-744.  [PubMed]  [DOI]
22.  Odeberg J, Yun Z, Sonnerborg A, Weiland O, Lundeberg J. Variation in the hepatitis C virus NS5a region in relation to hypervariable region 1 heterogeneity during interferon treatment. J Med Virol. 1998;56:33-38.  [PubMed]  [DOI]
23.  Khorsi H, Csatelain S, Wyseur A, Izopet J, Canva V, Rombout A, Capron D, Capron JP, Lunel F, Stuyver L. Mutations of hepatitis C virus 1b NS5A2209-2248 amino acid sequence do not predict the response to recombinant interferon-alfa therapy in French patients. J Hepatol. 1997;27:72-77.  [PubMed]  [DOI]
24.  Gerotto M, Dal Pero F, Pontisso P, Noventa F, Gatta A, Alberti A. Two PKR inhibitor HCV proteins correlate with early but not sustained response to interferon. Gastroenterology. 2000;119:1649-1655.  [PubMed]  [DOI]
25.  Nousbaum J, Polyak SJ, Ray SC, Sullivan DG, Larson AM, Carithers RL, Gretch DR. Prospective characterization of full-length hepatitia C virus NS5A quasispecies during induction and combination antiviraltherapy. J Virol. 2000;74:9028-9038.  [PubMed]  [DOI]
26.  Nousbaum JB, Pol S, Nalpas B, Landais P, Berthelot P, Bréchot C. Hepatitis C virus type 1b(II) infection in France and Italy. Ann Inter Med. 1995;122:161-168.  [PubMed]  [DOI]
27.  Booth JC, Foster GR, Kumar U, Galassini R, Goldin RD, Brown JL, Thomas HC. Chronic hepatitis C virus infection: predictive value of genotype and level of viraemia on disease progression and response to interferon ? Gut. 1995;36:427-432.  [PubMed]  [DOI]
28.  Van der Poel CL, Cuypers HT, Reesink HW. Hepatitis C virus six years on. Lancet. 1994;344:1475-147.  [PubMed]  [DOI]
29.  Kato N, Hijikata M, Ootsuyama Y, Nakagawa M, Ohkoshi S, Sugimura T, Shimotohno K. Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-A, non-B hepatitis. Proc Natl Acad Sci USA. 1990;87:9524-9528.  [PubMed]  [DOI]
30.  Chayama K, Suzuki F, Tsubota A, Kobayashi M, Arase Y, Saitoh S, Suzuki Y, Murashima N, Ikeda K, Takahashi N. Association of amino acid sequence in the PKR-eIF2 phosphorylation homology domain and response to interferon therapy. Hepatology. 2000;32:1138-1144.  [PubMed]  [DOI]
31.  段 学章, 朱 传琳, 程 云, 赵 军, 李 伯安, 季 伟. 丙型肝炎病毒1b型NS5A区基因结构变异与干扰素治疗效果的研究. 中华实验和临床病毒学杂志. 1999;4:368-370.  [PubMed]  [DOI]
32.  唐 振亚, Kock J, Moradpour D, 杨 东亮, 郝 连杰, Blum HE. 慢性丙型肝炎患者干扰素敏感决定区突变的意义. 中华肝脏病杂志. 1999;1:57.  [PubMed]  [DOI]