基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2003-07-15; 11(7): 986-989
在线出版日期: 2003-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i7.986
胃肠道平滑肌细胞作为eNOS基因转移靶细胞的研究
宁守斌, 张忠兵, 沈茜, 谢渭芬, 杨秀疆, 赵新, 信栓力
宁守斌, 张忠兵, 谢渭芬, 杨秀疆, 中国人民解放军第二军医大学附属长征医院消化内科上海市 200003
宁守斌, 男, 1973-11-06生, 甘肃省景泰县人, 汉族, 上海第二军医大学博士研究生, 主要从事胃肠激素与胃肠动力的研究.
沈茜, 中国人民解放军第二军医大学附属长海医院实验诊断科上海市 200433
赵新, 中国人民解放军第二军医大学附属长海医院血管外科上海市 200433
信栓力, 中国人民解放军第二军医大学附属长征医院心内科上海市 200003
通讯作者: 张忠兵, 200003, 上海市凤阳路415号, 中国人民解放军第二军医大学附属长征医院消化内科. zhongbingz@yahoo.com.cn
电话: 021-63610109-73254
收稿日期: 2002-10-09
修回日期: 2002-10-20
接受日期: 2002-10-30
在线出版日期: 2003-07-15

目的

构建内皮型一氧化氮合酶(eNOS)腺病毒表达载体, 介导eNOS在胃肠道平滑肌细胞中稳定表达并评价表达产物eNOS的酶学活性.

方法

构建牛eNOS的重组腺病毒表达载体Ad-eNOS, 感染体外培养的猫下段食管及胃底部平滑肌细胞, 采用Western blot 、 RT-PCR技术检测eNOS在平滑肌细胞中的表达, 测定基因转移后NOS活性以及一氧化氮(NO)产量, 并研究不同施加因素对NOS活性及NO合成的影响.

结果

Ad-eNOS可高效感染体外培养的胃肠平滑肌细胞(MOI = 50, 感染效率 = 74%), Western blot 、 RT-PCR结果证实eNOS在平滑肌细胞中高效表达. Ad-eNOS感染细胞后基础NOS活性比感染前显著增高(93±13 vs 47±13 nkat/L, P<0.05), 培养液中累积的NO增加了3倍(45±13 vs 16±7 μmol/L, P<0.05). 分别加入L-精氨酸(10-4 mol/L)、钙离子(10-4 mol/L)、EGTA(钙离子螯合剂, 10-4 mol/L)及L-NAME(NOS抑制剂, 10-3mol/L)后, NOS活性分别为94±8, 173±25, 29±6, 58±11 nkat/L, NO含量分别为48±14, 106±18, 6±2, 17±11 μmol/L.

结论

构建的重组腺病毒Ad-eNOS能够高效介导eNOS基因在消化道平滑肌细胞中表达, 表达产物eNOS活性受钙离子浓度调节, 其作用底物L-精氨酸并不是NO合成的限速步骤.

关键词: N/A
引文著录: 宁守斌, 张忠兵, 沈茜, 谢渭芬, 杨秀疆, 赵新, 信栓力. 胃肠道平滑肌细胞作为eNOS基因转移靶细胞的研究. 世界华人消化杂志 2003; 11(7): 986-989
Gastrointestinal smooth muscle cell as target for gene transfer of eNOS gene
Shou-Bin Ning, Zhong-Bing Zhang, Qian Sheng, Wei-Fen Xie, Xiu-Jiang Yang, Xin Zhao, Shuan-Li Xin
Shou-Bin Ning, Zhong-Bing Zhang, Wei-Fen Xie, Xiu-Jiang Yang, Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, The Second Military Medical University 200003, Shanghai, China
Qian Sheng, Department of Laboratory Diagnosis, Changhai Hospital, The Second Military Medical University 200433, Shanghai, China
Xin Zhao, Department of Vascular Surgery, Changhai Hospital, The Second Military Medical University 200433, Shanghai, China
Shuan-Li Xin, Department of cardiology, Changzheng Hospital, The Second Military Medical University 200003, Shanghai, China
Correspondence to: Zhong-Bing Zhang, Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital, The Second Military Medical University 200003, Shanghai, China. zhongbingzhang@hotmail.com
Received: October 9, 2002
Revised: October 20, 2002
Accepted: October 30, 2002
Published online: July 15, 2003

AIM

To generate an adenoviral vector carrying endothelial nitric-oxide synthase (eNOS) gene in order to mediate the expression of eNOS gene in gastrointestinal smooth muscle cells (SMC) and assess the enzyme activity of eNOS.

METHODS

A recombinant adenovirus (Ad-eNOS) containing the bovine eNOS cDNA fragment was generated by homologous recombination in bacteria. The SMC of distal part of esophagus and gastric fundus of cat were isolated and cultured in vitro and infected with Ad-eNOS. The expression of eNOS gene was detected by Western blot and RT-PCR. The enzyme activity of NOS and the output of NO in SMC were measured by NOS and NO assay kit, furthermore, the different effects of given factors on the enzyme activity and the yield of NO were studied.

RESULTS

The Ad-eNOS can infect the cultured SMC efficiently (MOI = 50, infection rate = 74%). Western blot and RT-PCR confirmed the expression of eNOS in those infected cells. After the cells had been infected with Ad-eNOS, the basal activity of NOS significantly increased from 47±13 nkat/L to 93±13/L (P<0.05), and the level of NO in cell culture supernatants increased by 3 fold (45±13 vs 16±7 μmol/L). In the presence of L-arginine (NOS enzyme substrate), calcium, EGTA (calcium chelating agent), and L-NAME (NOS inhibitor), NOS activity was 94±8, 173±25, 29±6, 58±11 nkat/L and NO level was 48±14, 106±18, 6±2, 17±11 μmol/L, respectively.

CONCLUSION

The constructed recombinant adenovirus, Ad-eNOS, can efficiently mediate the expression of eNOS gene in cultured SMC of digestive tract. The activity of eNOS can be regulated by the concentration of calcium. L-arginine is Not the rate-limiting step for nitric oxide generation from endothelial nitric oxide synthase.

Key Words: N/A
0 引言

一氧化氮(NO)与消化系统多种疾病的发生密切相关, 他作为一种重要的抑制性氮能神经递质, 与血管活性肠肽(VIP)共同介导胃肠平滑肌的松弛运动[1-3]. NO合成障碍是先天性巨结肠、贲门失弛缓症、弥漫性食管痉挛、肥厚性幽门梗阻、Oddi括约肌运动功能障碍等疾病发生的重要因素[4-16]. 另外NO可通过调节胃黏膜血流量及促进胃黏液分泌发挥黏膜保护作用, 有利于溃疡的愈合[17-21]. 但NO半衰期极短, 限制了其供体类药物的临床应用, 所以构建一种能在胃肠平滑肌细胞中稳定表达一氧化氮合酶(NOS)基因的真核表达载体, 使病变部位持续释放NO, 有可能为这些疾病的治疗提供一种新的思路和方法.

1 材料和方法
1.1 材料

编码牛eNOS的全长cDNA序列(4 092 bp)克隆在质粒eNOS-pcDNA3中, 由耶鲁大学Willian C. Sessa博士惠赠[22]; 腺病毒AdEasyTM系统包括穿梭质粒pAdTrack-CMV以及腺病毒骨架质粒pAdEasy-1, 由美国霍华德-休斯医学研究所He TC惠赠[23]. 鼠抗牛的eNOS单克隆抗体及驴抗鼠-IgG购自Santa Cruz公司, 限制性内切酶PmeⅠ, Pac-I购自BioLabs公司, 其他限制性内切酶Xba I, EcoR I, NotⅠ, HindⅢ以及T4 DNA连接酶、DNA片段胶回收试剂盒、1 kb及23 kb的DNA分子质量标准、RT-PCR试剂盒、脂质体LipofectAmine等分别购自Promega, Sigma, Gibco公司. NOS及NO测定试剂盒购自南京建成生物制品有限公司. 家猫两只购自第二军医大学实验动物中心.

1.2 方法

食管及胃底平滑肌细胞培养参考文献[24]并加以改进: 家猫氯氨酮麻醉后取1 cm长的下段食管组织及1.5×1cm胃底部组织, 剥离环行肌及纵行肌后分别用4 ml 1 g/L胶原酶、0.1 g/L胰蛋白酶抑制剂于31 ℃消化2次, 30 min/次 (每隔5 min用旋涡震荡器震荡一次)至组织呈絮状, 500 μm的分子筛过滤, 离心后细胞用含150 mL/L小牛血清的高糖(12 mmol/L)DMEM培养基将细胞数调至2×104, 接种于培养瓶中, 置于37 ℃, 50 mL/L CO2的孵箱内培养. eNOS-pcDNA3经NotⅠ及HindⅢ双酶切得到4.1 kb的目的条带, 胶回收后定向克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中形成转移质粒pAdTrack-CMV-eNOS, 后者与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1经电穿孔共同转化大肠杆菌BJ5183, 利用细菌内的同源重组机制进行重组[23], 形成重组腺病毒质粒Ad-eNOS. 将Ad-eNOS用脂质体介导转染293细胞包装成病毒颗粒, 反复感染293细胞扩增病毒获得高滴度的病毒上清, 氯化铯梯度超速离心纯化后通过计数报告基因绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞数测定病毒滴度. 用相同的方法构建对照病毒Ad-Track-CMV(将空的穿梭质粒pAdTrack-CMV与pAdEasy-1进行重组). 重组腺病毒Ad-eNOS感染效率的测定: 用不同MOI(10、50、100)的重组腺病毒Ad-eNOS感染体外培养的平滑肌细胞, 荧光显微镜下观察GFP的表达情况, 流式细胞仪测定病毒的感染效率. 重组病毒Ad-eNOS及对照病毒Ad-Track-CMV分别感染平滑肌细胞, 采用RT-PCR、Western blot等方法分别从基因转录水平及蛋白质水平测定eNOS基因在平滑肌细胞中的表达. 扩增250 bp长度eNOS的引物引自文献[25](5'primer: TCA ACC AGT ACT ACA GCT CC; 3' primer: GTG GTT GCA GAT GTA GGT GA), 扩增350 bp长度内参照β-actin 的引物自行设计(5' primer: AGA GCT ACG AGC TGC CTG AC; 3'primer: ACA TCT GCT GGA AGG TGG AC). 细胞培养液中NO含量及细胞中NOS活性的测定: 用50 MOI的Ad-eNOS及对照病毒Ad-Track-CMV分别感染实验组和对照组细胞(各孔细胞数控制在106左右, 培养液体积均为1.0 mL), 并分别于加入病毒之前、之后, 以及在培养液中分别加入L-精氨酸(L-Arg, 10-4 mol/L)、氯化钙(10-3 mol/L)、EGTA(Ca2+螯合剂, 10-4 mol/L)、硝基-L-精氨酸甲基酯(L-NAME, NOS抑制剂, 10-3mol/L)后吸取培养液分别测定NO含量及NOS活性. NOS酶活力单位定义: 每升细胞培养液中每秒钟生成1 nmol NO为1 nkat/L.

统计学处理 实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示, 感染前后自身对照采用配对t检验, 感染以后多个处理组间采用F检验进行统计学处理, P值＜0.05为显著性差异.

2 结果

转移质粒pAdTrack-CMV-eNOS构建后经鉴定正确, 将pAdTrack-CMV-eNOS及pAdTrack-CMV分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组形成重组腺病毒质粒Ad-eNOS和Ad-Track-CMV. 二者用Pac-I均切出了4.5 kb及大于23 kb两条带, 选用位于目的基因eNOS两侧的多克隆位点, 分别用EcoR I单酶切及Xba I, SalⅠ双酶切均出现了4.1 kb的目的条带, Ad-Track-CMV用Xba I酶切可使其线性化(图1). 证明两个重组病毒质粒构建成功. 重组质粒包装成重组病毒颗粒并扩增纯化后GFP计数法测得Ad-eNOS和Ad-Track-CMV病毒滴度分别为6×1012 pfu/L和4×1012pfu/L. 原代培养的食管及胃底平滑肌细胞生长至10-12 d大部分细胞融合, 二者在形态上无明显区别, 均呈现平滑肌细胞典型的"峰-谷"样生长方式(图2), 经抗α-actin免疫组织化学染色及电镜观察鉴定, 证明培养的细胞为平滑肌细胞, 纯度达到95%以上, 台盼蓝染色提示细胞存活率达到94%以上. 重组病毒感染平滑肌细胞后在荧光显微镜下可见平滑肌细胞内有GFP表达(图3), 流式细胞仪测定结果提示当MOI分别为10、50和100时感染效率分别为21%、74%和100%.

图1
图1 Ad-eNOS及Ad-Track-CMV酶切鉴定图谱. 1 λ-HindⅢ DNA Marker (23 kb); 2 Ad-Track-CMV (Pac I); 3 Ad-Track-CMV (Xba I) 4 Ad-eNOS (Pac I); 5 Ad-eNOS (EcoR I); 6 Ad-eNOS (Xba I、SalⅠ) λ-HindⅢ DNA Marker (1 kb).
图2
图2 食管平滑肌细胞培养10 d时呈现"峰-谷"状的生长方式(×50).
图3
图3 报告基因GFP在体外培养的食管平滑肌细胞中大量表达.
2.1 eNOS在食管及胃平滑肌细胞中的表达

RT-PCR结果提示, Ad-eNOS感染平滑肌细胞后可特异扩增出针对目的基因的片段, 而对照病毒感染的细胞未出现此条带(图4). Western blot结果证实, Ad-eNOS感染后, 无论细胞培养液中还是细胞裂解液中均出现了约135 kDa大小的特异性蛋白条带, 与eNOS基因产物的大小一致, 而对照组为阴性(图5).

图4
图4 RT-PCR结果: eNOS在平滑肌细胞中表达. 1 未感染病毒; 2 感染Ad-Track-CMV; 3 感染eNOS-Adλ-HindⅢ DNA Marker(×100 bp).
图5
图5 Western blot 结果. 1 感染eNOS-Ad平滑肌细胞培养基上清; 2 感染eNOS-Ad平滑肌细胞裂解液; 3 感染Ad-Track-CMV平滑肌细胞裂解液; 4 蛋白质分子量标准.
2.2 NO含量及NOS活性测定结果

Ad-eNOS感染后平滑肌细胞中NOS活性、培养液中NO含量均比感染前及对照组明显增加(P＜0.05, 表1). 培养液中加入L-精氨酸(NOS作用底物)后NOS活性、NO代谢产物含量无明显变化(P>0.05), 但加入钙离子后NOS活性增加、NO含量显著升高(P＜0.05), 而钙离子螯和剂EGTA几乎可以完全抑制酶的活性. NOS抑制剂L-NAME也可明显抑制NOS活性, 使培养液中NO含量减少(P＜0.05).

表1 NOS活性及NO含量的测定结果(mean±SD, n = 10).
NOS(nkat/L)NO(μmol/L)
空白组47±1315.64±6.62
Ad-Track-CMV45±1413.74±9.32
Ad-eNOS97±13ac45.37±12.65ac
L-Arg94±848±14
Ca2+173±25e106±18e
EDTA29±6e6±2e
L-NAME58±11e17±11e
aP<0.05 vs 空白组,
cP<0.05 vs Ad-Track-CMV, aP<0.05 vs Ad-eNOS.
3 讨论

催化产生NO的一氧化氮合酶(NOS)有三种亚型: 即神经元型(nNOS)、诱导型(iNOS)及Ca2+/钙调素(CaM)依赖结合型(eNOS), 分别由不同的基因编码[26-28]. 人们通常将nNOS和eNOS合称为结构型一氧化氮合酶(cNOS), 其活性为Ca2+/CaM依赖性, 受细胞内Ca2+浓度的生理性调节, 而iNOS活性为非Ca2+依赖性, 其表达受内毒素、IL-1等诱导. 结构型一氧化氮合酶广泛分布于胃肠道, nNOS主要分布在胃肠肌间神经丛, eNOS主要分布在胃肠平滑肌细胞、肠壁血管内皮及血管平滑肌细胞, 二者也可共存于一些黏膜固有层细胞中[29-32]. NO合成障碍与先天性巨结肠、贲门失弛缓症、弥漫性食管痉挛、特发性肠梗阻、肥厚性幽门梗阻、便秘等疾病的发生密切相关, 而且NO可以促进溃疡的愈合. 若将外源性的eNOS基因转移至相应部位平滑肌细胞使之产生NO, 理论上对这些疾病能发挥有效的治疗作用.

我们利用细菌内同源重组法构建了携带目的基因eNOS的重组腺病毒载体. 腺病毒不仅能够高效感染多种增生细胞, 而且也能感染静息哺乳类细胞, 且不与细胞的基因组发生整合, 不引起基因突变, 可以携带较大片段的外源基因, 是一种比较理想的用于基因治疗的表达载体[33,34]. 平滑肌细胞是组成胃肠道最重要的组织细胞之一, 是引起胃肠运动的效应细胞, 在生理情况下胃肠道平滑肌细胞内有低丰度的eNOS表达[2], 所以胃肠平滑肌细胞可作为表达外源eNOS基因产生NO的理想场所, 是进行基因治疗的理想靶细胞. 我们在体外成功分离培养了较高纯度的食管及胃底平滑肌细胞, 并证明构建的eNOS重组腺病毒Ad-eNOS能高效感染体外培养的平滑肌细胞, 从而成功介导了外源基因eNOS在平滑肌细胞中的表达. 进一步的实验表明, 基因表达产物eNOS的活性受到Ca2+浓度的调节, 符合其Ca2+/CaM依赖性的生化特征. 底物L-精氨酸似乎并不是酶促反应的限速步骤, 可能是由于eNOS的Km值(酶促反应速度达到最大速度一半时的底物浓度)很低, 细胞培养液中的浓度远远超过这个值, 而且平滑肌细胞可通过尿素循环将L-瓜氨酸再转化为L-精氨酸而被循环利用[35], 这就保证了基因转移后在体内不会由于底物缺乏而影响NO的产生.

1.  Bult H, Boeckxstaens GE, Pelckmans PA, Jordaens FH, Van Maercke YM, Herman AG. Nitric oxide as an inhibitory non-adrenergic non-cholinergic neurotransmitter. Nature. 1990;345:346-347.  [PubMed]  [DOI]
2.  Teng B, Murthy KS, Kuemmerle JF, Grider JR, Sase K, Michel T, Makhlouf GM. Expression of endothelial nitric oxide synthase in human and rabbit gastrointestinal smooth muscle cells. Am J Physiol. 1998;275:G342-351.  [PubMed]  [DOI]
3.  Kurjak M, Fritsch R, Saur D, Schusdziarra V, Allescher HD. Functional coupling between nitric oxide synthesis and VIP release within enteric nerve terminals of the rat: involvement of protein kinase G and phosphodiesterase 5. J Physiol. 2001;534:827-836.  [PubMed]  [DOI]
4.  Sivarao DV, Mashimo HL, Thatte HS, Goyal RK. Lower esophageal sphincter is achalasic in nNOS (-/-) and hypotensive in W/W(v) mutant mice. Gastroenterology. 2001;121:34-42.  [PubMed]  [DOI]
5.  Kusafuka T, Puri P. Altered mRNA expression of the neuronal nitric oxide synthase gene in Hirschsprung's disease. J Peiatr Surg. 1997;32:1054-1058.  [PubMed]  [DOI]
6.  Shima Y, Mori M, Takakura N, Tanaka N, Yokoi I, Kabuto H, Yamazato T. Continuous monitoring of nitric oxide release induced by cholecystokinin from the choledochal sphincter in guinea pigs. Digestion. 2000;61:135-139.  [PubMed]  [DOI]
7.  Chiu JH, Lui WY, Chen YL, Hong CY. Local somatothermal stimulation inhibits the motility of sphincter of Oddi in cats, rabbits and humans through nitrergic neural release of nitric oxide. Life Sci. 1998;63:413-428.  [PubMed]  [DOI]
8.  Shima Y, Mori M, Harano M, Tsuge H, Tanaka N, Yamazato T. Nitric oxide mediates cerulein-induced relaxation of canine sphincter of Oddi. Dig Dis Sci. 1998;43:547-553.  [PubMed]  [DOI]
9.  Millar AJ, Steinberg RM, Raad J, Rode H. Anal achalasia after pull-through operations for Hirschsprung's disease-preliminary experience with topical nitric oxide. Eur J Pediatr Surg. 2002;12:207-211.  [PubMed]  [DOI]
10.  Saur D, Paehge H, Schusdziarra V, Allescher HD. Distinct expression of splice variants of neuronal nitric oxide synthase in the human gastrointestinal tract. Gastroenterology. 2000;118:849-858.  [PubMed]  [DOI]
11.  De Giorgio R, Di Simone MP, Stanghellini V, Barbara G, Tonini M, Salvioli B, Mattioli S, Corinaldesi R. Esophageal and gastric nitric oxide synthesizing innervation in primary achalasia. Am J Gastroenterol. 1999;94:2357-2362.  [PubMed]  [DOI]
12.  Lui H, Vanderwinden JM, Ji P, De Laet MH. Nitric oxide synthase distribution in the enteric nervous system of children with cardiac achalasia. Chin Med J. 1997;110:358-361.  [PubMed]  [DOI]
13.  Faussone-Pellegrini MS, Infantino A, Matini P, Masin A, Mayer B, Lise M. Neuronal anomalies and normal muscle morphology at the hypomotile ileocecocolonic region of patients affected by idiopathic chronic constipation. Histol Histopathol. 1999;14:1119-1134.  [PubMed]  [DOI]
14.  Subramaniam R, Doig CM, Moore L. Nitric oxide synthase is absent in only a subset of cases of pyloric stenosis. J Pediatr Surg. 2001;36:616-619.  [PubMed]  [DOI]
15.  Gentile C, Romeo C, Impellizzeri P, Turiaco N, Esposito M, Di Mauro D, Mondello MR. A possible role of the plasmalemmal cytoskeleton, nitric oxide synthase, and innervation in infantile hypertrophic pyloric stenosis. A confocal laser scanning microscopic study. Pediatr Surg Int. 1998;14:45-50.  [PubMed]  [DOI]
16.  Guo R, Nada O, SuitaS , Taguchi T, Masumoto K. The distribution and co-localization of nitric oxide synthase and vasoactive intestinal polypeptide in nerves of the colons with Hirschsprung disease. Virchows Arch. 1997;430:53-61.  [PubMed]  [DOI]
17.  Khattab MM, Gad MZ, Abdallah D. Protective role of nitric oxide in indomethacin-induced gastric ulceration by a mechanism independent of gastric acid secretion. Pharmacol Res. 2001;43:463-467.  [PubMed]  [DOI]
18.  乐 桥良, 文 晓冬. 大鼠应激性溃疡中一氧化氮的作用. 世界华人消化杂志. 2000;8:815-816.  [PubMed]  [DOI]
19.  余 贤恩, 罗 绮凝. 外源性一氧化氮对豚鼠酸化乙醇性胃黏膜损伤的保护作用. 世界华人消化杂志. 2000;8:224.  [PubMed]  [DOI]
20.  曾 锦章, 张 万岱, 刘 晓霞, 张 振书, 张 亚历, 周 殿元. 蛋白酪氨酸激酶与一氧化氮合酶活性的变化在胃黏膜损伤修复中的作用和意义. 世界华人消化杂志. 2000;8:354-355.  [PubMed]  [DOI]
21.  闫 长栋, 李 平, 祁 友键. 大鼠胃扩张致胃酸分泌中NO对胃黏膜血流量的影响. 世界华人消化杂志. 2000;8:1067-1068.  [PubMed]  [DOI]
22.  Sessa WC, Harrison JK, Barber CM, Zeng D, Durieux ME, D扐ngelo DD, LynchKR , Peach MJ. Molecular cloning and expression of a cDNA encoding endothelial cell nitric oxide synthase. J Biol Chem. 1992;267:15274-15276.  [PubMed]  [DOI]
23.  He TC, Zhou S, da Costa LT, Yu J, Kinzler KW, Vogelstein B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95:2509-2514.  [PubMed]  [DOI]
24.  Yuan QX, McRoberts JA, Lakshmanan J, Yagi H, HymanPE . Newborn rabbit gastric smooth muscle cell culture: EGF and TGF-alpha are potent mitogens. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1993;17:153-160.  [PubMed]  [DOI]
25.  Kalra M, Jost CJ, Severson SR, Miller VM. Adventitial versus intimal liposome-mediated ex vivo transfection of canine saphenous vein grafts with endothelial nitric oxide synthase gene. J Vasc Surg. 2000;32:1190-1200.  [PubMed]  [DOI]
26.  Zhang J, Patel JM, Block ER. Molecular cloning, characterization and expression of a nitric oxide synthase from porcine pulmonary artery endothelial cells. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 1997;116:485-491.  [PubMed]  [DOI]
27.  Iwashina M, Hirata Y, Imai T, Sato K, Marumo F. Molecular cloning of endothelial, inducible nitric oxide synthase gene from rat aortic endothelial cell. Eur J Biochem. 1996;237:668-673.  [PubMed]  [DOI]
28.  Ogura T, Yokoyama T, Fujisawa H, Kurashima Y, Esumi H. Structural diversity of neuronal nitric oxide synthase mRNA in the nervous system. Biochem Biophys Res Commun. 1993;193:1014-1022.  [PubMed]  [DOI]
29.  Chen YM, Qian ZM, Zhang J, Chang YZ, Duan XL. Distribution of constitutive nitric oxide synthase in the jejunum of adult rat. World J Gastroenterol. 2002;8:537-539.  [PubMed]  [DOI]
30.  Lindestrom LM, Ekblad E. Origins and projections of nerve fibres in rat pyloric sphincter. Auton Neurosci. 2002;97:73-82.  [PubMed]  [DOI]
31.  Konig P, Dedio J, Muller-Esterl W, Kummer W. Distribution of the novel eNOS-interacting protein NOSIP in the liver, pancreas, and gastrointestinal tract of the rat. Gastroenterology. 2002;123:314-24.  [PubMed]  [DOI]
32.  Peng X, Feng JB, Yan H, Zhao Y, Wang SL. Distribution of nitric oxide synthase in stomach myenteric plexus of rats. World J Gastroenterol. 2001;7:852-854.  [PubMed]  [DOI]
33.  DavisAR , Wivel NA, Palladino JL, Tao L, Wilson JM. Construction of adenoviral vectors. Mol Biotechnol. 2001;18:63-70.  [PubMed]  [DOI]
34.  Breyer B, Jiang W, Cheng H, Zhou L, Paul R, Feng T, He TC. Adenoviral vector-mediated gene transfer for human gene therapy. Curr Gene Ther. 2001;1:149-162.  [PubMed]  [DOI]
35.  Mohacsi T, Mozes G, Sato J, Gloviczki P, Katusic Z, O'Brien T. L-arginine availability is Not limiting for nitric oxide generation from recombinant endothelial nitric oxide synthase. Vasc Res. 1999;36:437-444.  [PubMed]  [DOI]