应用表达谱芯片技术对丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式调节基因的研究

摘要

目的

应用基因表达谱芯片研究丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)的反式调节基因.

方法

构建NS5A基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A, 应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5A转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.

结果

HepG2细胞经转染NS5A后, 有54条差异基因表达, 其中28条基因表达增强, 26条基因表达降低. 这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.

结论

应用基因表达谱芯片成功筛选了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式调节基因, 为进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

关键词: N/A

Genes trans-regulated by nonstructural protein 5A of hepatitis C virus with microarray assay

Yuan Hong, Yan Liu, Jun Cheng, Qian Yang, Jian-Jun Wang

Yuan Hong, Yan Liu, Jun Cheng, Qian Yang, Jian-Jun Wang, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China

Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. C03011402, No. C30070689, and Returned Scholarship of General Logistics Department of PLA, No. 98H038.

Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, 100 Xisihuanzhonglu, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn

Received: January 11, 2003
Revised: February 20, 2003
Accepted: March 21, 2003
Published online: July 15, 2003

Abstract

AIM

To study genes trans-regulated by nonstructural protein 5A of hepatitis C virus by microarray assay.

METHODS

The recombined expression plasmid pcDNA3.1(-)-NS5A was constructed, and HepG2 cells were transfected. Total mRNA was isolated from the HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-) and pcDNA3-NS5A, respectively. Microarray was employed for detecting and analyzing of both mRNA from the HepG2 cells.

RESULTS

After transfecting HepG2 cells, we found 28 genes have been up-regulated, and 26 genes down-regulated. Their encoding proteins were involved in cell signal transduction, cell proliferation and differentiation.

CONCLUSION

Microarray technology is successfully used to screen the genes trans-regulated by nonstructural protein 5A of hepatitis C virus, which brings some new clues for studying the trans-regulated and immune regulation mechanism of NS5A.

Key Words: N/A

0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒属, 是含外膜蛋白的单股正链RNA病毒. 在大多数感染人群中丙型肝炎病毒表现为持续性感染, 并可导致慢性肝炎、肝硬化, 或肝细胞癌, 而且与肝脏脂肪变、糖代谢紊乱有关[1-10]. 其基因组含有单一的开放读码框架, 编码3010-3033个氨基酸残基的多肽前体, 两侧是5'-非翻译区及3'-非翻译区. 因为HCV的基因复制形式没有经过DNA阶段, 不存在HCV基因组与肝细胞基因组DNA的整合, 所以, HCV主要是通过基因组编码蛋白和肝细胞蛋白之间的相互作用及肝细胞蛋白与HCV调节基因的相互作用造成对肝细胞的损伤. 其多肽前体至少被加工为十种结构蛋白和非结构蛋白, 其中非结构蛋白NS5A基因(位于6258-7601 nt之间)编码的58 kD的NS5A蛋白(448 aa)具有多种生物学功能, 在HCV多蛋白的成熟和RNA的复制过程中具有十分重要的作用[11-14]. 研究表明, NS5A上存在干扰素α敏感决定区(ISDR), 与干扰素治疗的敏感性相关[15,16]; 此外, NS5A还是一种作用很强转录激活因子[17-21], 调控着细胞内许多病毒及细胞基因的转录, 与感染HCV的细胞发生恶性转化过程有关. 对于NS5A蛋白的反式调节功能, 我实验室已证明他可以反式激活SV40早期启动子/增强子[21]. 并应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)对NS5A的反式调节基因进行了初步的研究[22]. 为了从不同的角度对NS5A的反式调节基因进行验证及研究, 我们应用基因表达谱芯片技术(cDNA microarray)[23-26]对于HCV的NS5A反式调节的靶基因成功地进行了筛选, 为今后更加广泛深入地研究NS5A的反式调节基因打下了基础.

1 材料和方法

1.1 材料

人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞由本室保存, 细胞培养相关试剂及总RNA提取试剂Trizol购自Gibco公司, FuGENE购自Roche公司, 丙型肝炎病毒非结构蛋白5A真核表达质粒由本室构建[21]. 表达谱芯片由上海联合基因有限公司提供.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和取材 在35 mm培养皿中常规培养HepG2细胞, 细胞生长至对数期时, 以脂质体转染试剂FuGENE分别将2 μgpcDNA3.1(-)-NS5A和空载体pcDNA3.1(-)转染HepG2细胞, 48 h后收获细胞, 每5106个细胞加入1 mL Trizol试剂, 立即于液氮中保存.

1.2.2 总RNA提取 使用Trizol试剂一步法提取丙型肝炎病毒非结构蛋白5A表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A和空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞总RNA(分别标记为实验组和对照组), 样品经分光光度计检测吸光度A值, 并行热稳定实验, 于-20 °C和70 °C保温1 h后, 经琼脂糖凝胶电泳检测28S、18S条带变化.

1.2.3 探针标记 参照Schena et al[27]方法逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA(5 μg), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 μg). 乙醇沉淀后溶解在20 μL×5SC+2 g/L SDS杂交液中.

1.2.4 芯片制备 芯片包含的1 152个cDNA, 包括原癌基因、抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1000-3000 bp. 靶基因以0.5 μg/μL溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7500 点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), 紫外线交联, 再分别用2 g/L SDS、双蒸水及2 g/L 硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.

1.2.5 预杂交 将预杂交液放入95 °C水浴锅内变性2 min, 将待预杂交的芯片放入95 °C水浴锅内变性30 s, 芯片取出后即放入无水乙醇中30 s, 晾干. 将已变性的预杂交液加到芯片的点样区域内, 盖上盖玻片, 放入杂交箱内42 °C预杂交5-6 h.

1.2.6 杂交及洗涤 将探针置于95 °C水浴中变性2 min; 芯片置于95 °C水浴中变性30 s, 芯片取出浸于无水乙醇30 s, 探针取出后迅速置于冰上. 将探针置于芯片上, 用盖玻片覆盖, 置于杂交舱中, 用Parafilm密封, 放入42 °C杂交箱内杂交过夜(16-18 h). 依次以2碨SC+ 2 g/L SDS、1:1000 SSC +2 g/L SDS、1:1000 SSC洗涤10 min, 室温晾干.

1.2.7 扫描与分析 用General Scanning公司的ScanArray 3000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值.阳性结果判断: Cy5/Cy3＞2.0, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3＜0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱.

2 结果

2.1 总RNA的定性、定量分析

总RNA的吸光度A260/A280>1.92, 热稳定实验70 °C保温1 h与-20 °C 1 h的电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA.

2.2 芯片杂交体系验证及结果分析

在芯片上共有1152个cDNA. 为了监控芯片杂交体系, 在芯片上设置了阴性对照(8条水稻基因, 共8个点), 这些点的杂交信号均很低, 证实了数据的可靠性. 由于实验组探针标记Cy5荧光素(呈红色), 对照组探针标记Cy3荧光素(呈绿色), 红绿颜色的差异就显示该基因在实验组和对照组中基因表达水平上的差异, 黄色代表表达水平无差异. 按阳性标准, 从1000个基因中筛选出差异表达基因共54条, 占5.4%, 其中28条基因表达增强, 26条基因表达降低.

2.3 差异表达基因分析

表达增强的基因有28条(表1). 表达降低的基因有26条(表2).

表1 表达显著增加的基因.

编号	编码蛋白	Cy5/Cy3
1	晶状体上皮衍生生长因子	2.023
2	RET指蛋白	2.035
3	神经紧张素(NTS)	2.042
4	γ氨基丁酸A受体α5(GABRA5)	2.096
5	未知克隆KAIA04052	2.149
6	DNA介导的RNA聚合酶2, 多肽B(POLR2B)	2.167
7	淋巴细胞性白血病缺失因子2(DLEU2)	2.169
8	Cullin蛋白2(CUL2)	2.179
9	造血细胞特异性Lyn底物1(HCLS1)	2.225
10	冯希林综合征特异蛋白(VHL)	2.238
11	半乳糖基转移酶相关蛋白激酶	2.239
12	未知克隆MGC: 9535	2.266
13	溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)	2.324
14	甾醇C5脱氢酶(SC5DL)	2.330
15	未知蛋白KIAA0824	2.341
16	TGF-βIIR-α	2.369
17	斯库瓦诺明相互作用蛋白1(SCHIP1)	2.373
18	谷氨酸受体3(GRM3)	2.375
19	类DnaJ的热休克蛋白40(HLJ1)	2.380
20	蛋白酪氨酸磷酸酶ⅣA型, 1号(PTP4A1)	2.391
21	B细胞CLL/淋巴瘤10因子(BCL10)	2.408
22	Ⅺ型胶原蛋白α1(COL11A1)	2.425
23	cAMP依赖调控的蛋白激酶Ⅱ型II型βPRKAR2B)	2.462
24	Ran结合蛋白2(RanBP2alpha)	2.471
25	未知蛋白KIAA0035	2.574
26	未知克隆HEPO1185	2.586
27	推定蛋白FLJ20507	2.702
28	未知蛋白KIAA1641	3.401

表2 表达显著降低的基因.

编号	编码蛋白	Cy5/Cy3
1	热休克蛋白1A(HSPA1A)	0.217
2	肌动蛋白结合LIM蛋白1(ABLIM)	0.328
3	核受体亚家族3, C族1号(NR3C1)	0.338
4	基质金属蛋白酶1(MMP1)	0.352
5	多囊肾病相关蛋白1(PKD1)	0.365
6	含TCP1的伴侣蛋白, 亚单位6A(CCT6A)	0.403
7	组织蛋白酶D(CTSD)	0.418
8	MMSET型1(WHSC1)	0.420
9	缬氨酰tRNA合成酶2(VARS2)	0.426
10	钙激活蛋白酶小亚单位1(CAPNS1)	0.428
11	甲状球蛋白(TG)	0.430
12	白介素7受体(IL7R)	0.433
13	孕激素诱导蛋白(DD5)	0.438
14	与κB结合蛋白相关的核因子(NFR?B)	0.444
15	推定蛋白FLJ20432	0.448
16	肌管球蛋白相关蛋白8(MTMR8)	0.458
17	激酶锚定蛋白12(AKAP12)	0.458
18	结肠癌抗原3(SDCCAG3)	0.458
19	视网膜母细胞瘤1(RB1)	0.459
20	肾上腺素氧化酶A(MAOA)	0.467
21	未知蛋白KIAA1723	0.472
22	蛋白激酶抑制物α(PKIA)	0.479
23	白介素3受体α(IL3RA)	0.483
24	细胞色素P450, 亚家族ⅪA(CYP11A)	0.485
25	细胞周期蛋白激酶(CDKL2)	0.487
26	S100钙结合蛋白A11(S100A11)	0.495

3 讨论

研究显示丙型肝炎病毒(HCV)感染与肝纤维化及肝细胞癌(HCC)的发生密切相关, 其中病毒编码的NS5A蛋白起着重要的作用. HCV NS5A位于HCV多蛋白的羧基末端, 是丝氨酸磷酸化蛋白质, 依磷酸化程度的不同而产生两种不同分子量大小的多肽p56和p58. 由于NS5A表现出对抗干扰素α(IFNα) 的治疗效应而引起人们广泛的关注, NS5A能够与肝细胞中的IFN刺激蛋白-双链RNA依赖的激酶(PKR)相互作用, 抑制PKR的功能, 从而下调IFN刺激的抗病毒效应[15,16]. Kato et al[19,20]研究发现, NS5A是转录反式激活因子, 其羧基末端富含酸性氨基酸及脯氨酸, 这是真核细胞转录因子特有的结构特征, 但是其参与细胞转录调节的机制仍不十分清楚. 一般来说, 转录的反式激活因子是在细胞核中起作用的, 而NS5A定位于细胞内质网, 因此推测NS5A可能参与了细胞信号传导途径. NS5A能够反式激活核转录因子NF-κB及STAT3, 在细胞炎症反应、肿瘤发生及转移过程中起重要作用[28]. Ghosh et al[29]研究发现, NS5A蛋白能够抑制细胞周期调节基因p21^WAF1, 激活人肝癌细胞中增生细胞核抗原(PCNA)基因, 从而调节细胞凋亡, 促进细胞增生. NS5A cDNA能够使转染的小鼠成纤维细胞NIH 3T3具有转化特性, 且转化细胞移植入裸鼠体内可形成纤维肉瘤灶, 这一证据直接证明了HCV NS5A蛋白的恶性转化潜能.

因基因表达谱芯片技术可快速有效地检测到两组组织或细胞基因表达谱的差异, 故在HCV感染及其致癌机制的研究中具有重要的应用价值. Girard et al[30]应用基因芯片技术, 对于转染了NS5A蛋白的肝癌细胞系在受干扰素刺激后的基因表达谱变化进行了研究. 他们发现50种基因的表达水平变化在2倍以上, 41种表达上调, 9种表达下降. 其中表达影响最大的基因是OAS-p69. 表达NS5A的肝癌细胞系Huh7中IL-8的表达水平显著上调. 向Huh7培养系统中加入白介素8(IL-8), 就象转染NS5A基因一样, 抑制干扰素诱导的抗病毒活性, 包括下调OAS-p69基因的表达. 本实验我们用分子生物学技术构建了NS5A的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A, 并用空载体作为阴性对照, 利用脂质体转染HepG2细胞, 之后从中提取总RNA, 逆转录为cDNA, 进行基因芯片技术分析. 结果表明, 28种基因的表达水平上调, 26种基因的表达水平下调. 这些基因包括细胞生长、细胞凋亡、信号传导、免疫调节、肿瘤发生等基因, 其中在上调基因中, 有多条基因与免疫调节相关, 如淋巴细胞性白血病缺失因子2、B细胞CLL/淋巴瘤10因子及斯库瓦诺明相互作用蛋白1, 斯库瓦诺明是负性生长调节因子, 可以与肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶作用底物(HRS)相互作用, 发挥其生物功能[31], 而cAMP依赖调控的蛋白激酶的表达增强则提示NS5A在细胞信号转导的重要步骤中可能起着一定作用. 在下调基因中, 钙激活蛋白酶、白介素7受体、白介素3受体、细胞周期蛋白激酶、S100钙结合蛋白、蛋白激酶抑制物及κB结合蛋白相关的核因子的差异表达表明NS5A与细胞信号传导, 细胞周期调节及免疫调节有关. 将这一结果与应用SSH技术对NS5A反式调节基因的结果比较, 发现都有未知蛋白KIAA1641的上调表达, 我们下一步将对这一未知蛋白进行更深入的研究.

总之, 本研究的结果表明, NS5A对于肝细胞的基因表达谱有显著的影响, 基因芯片技术是研究反式调节基因的有效技术. 他为我们进一步深入研究NS5A的反式调节基因及其抗干扰素治疗的机制打下了重要基础.

备注

$[Footnotes]

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