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世界华人消化杂志. 2003-07-15; 11(7): 1018-1020
在线出版日期: 2003-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i7.1018
丙型肝炎病毒NS5A蛋白的反式激活作用研究
王建军, 刘妍, 成军, 杨倩, 杨艳杰
王建军, 刘妍, 成军, 杨倩, 杨艳杰, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市 100039
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetheray.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-01-11
修回日期: 2003-01-20
接受日期: 2003-02-16
在线出版日期: 2003-07-15

N/A

关键词: N/A
引文著录: 王建军, 刘妍, 成军, 杨倩, 杨艳杰. 丙型肝炎病毒NS5A蛋白的反式激活作用研究. 世界华人消化杂志 2003; 11(7): 1018-1020
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: January 11, 2003
Revised: January 20, 2003
Accepted: February 16, 2003
Published online: July 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)是一种单股正链RNA病毒, 编码一种多蛋白分子, 在病毒和宿主细胞蛋白酶的共同裂解作用下, 至少裂解为3种结构蛋白(C、E1和E2)和6种非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[1,2]. NS5A是非结构蛋白的一种, 哺乳动物细胞表达的NS5A蛋白以两种形式存在, 分子量分别为56 kD和58 kD. HCV NS5A是HCV基因组编码的一种最为重要的具有多种生物学活性的非结构蛋白质[3-5], 是HCV基因组编码的一种具有反式激活作用等多种生物学活性的非结构蛋白质. 其基因序列的变异, 决定部分HCV病毒株对于IFN-α治疗的疗效应答. HCV NS5A蛋白还具有结合双链RNA激酶(PKR)的生物学活性, 对于HCV感染的靶细胞的细胞周期与细胞凋亡的分子生物学调节机制密切相关[6].

1 NS5A反式激活作用位点

反式激活作用(transactivation)是基因组中一部分基因片段通过其转录或翻译产物(通常为编码蛋白), 激活另一部分基因片段的转录调节序列, 上调基因的表达. 近年研究发现, NS5A是转录反式激活因子, 其羧基末端富含酸性氨基酸及脯氨酸, 这是真核细胞转录因子特有的结构特征. 但是其参与细胞转录调节的机制仍不十分清楚[7-9]. 一般来说, 转录的反式激活因子是在细胞核中起作用的, 而NS5A定位于细胞内质网(ER), 因此推测NS5A可能参与了细胞信号转导途径.

最近的研究表明缺失N-末段146个氨基酸残基和DNA结合区域在GAL4(一种酵母细胞转录激活因子)的HCV NS5A蛋白可强烈的激活酵母和哺乳动物细胞的转录活性. 结合到GAL4 DNA结合区域的全长的HCV NS5A蛋白并没有激活转录的作用, NS5A片段转录激活作用最强的位点定位于2135和2331位氨基酸残基之间[10]. NS5A的转录激活区域包括两个酸性氨基酸区(2143-2184, 2220-2273氨基酸残基)和一个脯氨酸富集区(2282-2327氨基酸残基), 被认为是NS5A的转录活性区域[11]. 酸性氨基酸区的酸性氨基酸残基的数量与NS5A的反式激活活性相关, 两个酸性氨基酸区是NS5A的转录激活作用的核心区域, 因此酸性氨基酸区2的一些氨基酸的突变可明显影响NS5A的转录激活作用, 但是这些突变更多的是引起蛋白的二级结构的改变[12]. 脯氨酸富集区被认为对NS5A的转录激活作用只有一定的加强作用, 相对而言并不重要.

蛋白N-末段的功能了解的很少, 据推测N-末段的功能区域可与C-末段的酸性区域形成分子内的结合位点, 并可以掩盖酸性氨基酸区域的转录激活作用. 在HCV感染细胞, NS5A与其他细胞或病毒蛋白的相互作用可能会改变这种结构并使酸性氨基酸区域发挥转录激活作用[11], 这种假设仍处在实验阶段. 尽管已有明确证据显示NS5A蛋白全长定位于细胞质内, 在细胞核内仍可以检测到NS5A的N-末段的定位信号[13], 这就提示这部分结构可进入细胞核内并成为转录激活因子的一部分.

Satoh et al[14]检测了各种不同的N-或C-端片段在细胞内瞬时转染后的表达及分析他们的亚细胞定位. N-末端定位于细胞核, 并且NS5A N-末端的27个氨基酸序列有足够的能力使正常的核蛋白滞留在细胞质内. 这些发现说明NS5A的细胞质定位首先是由分子的N-末端决定的. 另外在瞬时表达细胞中, NS5A蛋白存在蛋白的分解处理过程. 在这些细胞中, 裂解片段发生在NS5A的一些C-和N-末端. 细胞内的这些片段可被凋亡调理素激活, 被天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK抑制, 提示天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶类蛋白水解酶对NS5A的裂解有一定作用. 基于NS5A变异分析的结果, 可以预测一个缺失了NS5A C-末端和N-末端, 长155到389个氨基酸残基的片段, 包含这些氨基酸序列的多肽产物定位于细胞核. 此外, 只有在共同产生蛋白激酶A(PKA)的α催化亚单位时, 一种包含Gal4 DNA结合区的融合蛋白与这种片段融合, 才表现转录活性, 提示这种片段的转录活性受PKA调控. 这些结果说明NS5A的这种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶类蛋白水解酶裂解产物对感染HCV的宿主细胞基因的转录活动起调控作用.

2 NS5A反式激活作用因子

Gong et al[15]研究发现, NS5A能够反式激活核转录因子NF-κB及STAT3, 在细胞炎症反应、肿瘤发生及转移过程中起重要作用. NS5A在细胞质内通过氧化应激作用激活NF-κB和STAT-3转录因子. NS5A引起细胞内钙离子的紊乱. Ca2+作为第二信使激发线粒体内的活性氧簇的水平, 使NF-κB和STAT-3易位入细胞核内. 有证据表明STAT-3的激活部分有NS5A的作用. 在抗氧化剂[pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)]或者Ca2+拮抗剂(EGTA-AM, TMB-8)作用下, NS5A诱导的NF-κB和STAT-3的反式激活作用消失了. 这些结果说明了NS5A可引起细胞内与病毒感染相关的病理改变的发病机制.

Ghosh et al[16]研究发现, NS5A蛋白能够抑制细胞周期调节基因p21WAF1的表达, 已知p21WAF1是细胞周期调节中的一种主要的抑制作用蛋白类型, HCV NS5A对于p21WAF1表达的抑制, 实际上就是对于细胞周期的促进作用. HCV NS5A对于细胞周期的调节作用还表现在激活人肝癌细胞中增生的细胞核抗原(PCNA)基因, 从而调节细胞凋亡, 促进细胞增生. 研究证实, 将HCV NS5A导入到小鼠成纤维细胞NIH 3T3中, 可以导致其贴壁非依赖性生长以及获得在裸小鼠体内形成肿瘤病灶的能力. 这些都是HCV NS5A通过反式激活作用对于靶细胞中细胞周期调节机制干扰的结果, 可能是HCV感染致肝细胞恶性转化的重要机制之一.

Lan et al[17]研究了HCV NS5A在HCV的致瘤转换中起重要作用. 由于肿瘤抑制因子p53对阻止细胞的致瘤性转化有重要作用, 故研究了HCV NS5A对p53功能影响. 应用体内和体外免疫共沉淀和共聚焦显微镜来研究HCV NS5A和p53的相互作用. HCV NS5A与p53在细胞核周区域直接结合. 通过报告基因分析, HCV NS5A抑制p53引起的对复制的反式激活作用. 应用FLAG-和FLAG-NS5A Hep3B稳定细胞系, 发现HCV NS5A可下调p53活化的Hep3B细胞引起内源性的p21/waf1的表达. 在伴有p53的NS5A稳定转染和瞬时转染的Hep3B细胞系中, 应用流式细胞分析检测NS5A对p53介导的细胞凋亡的作用. NS5A可解除p53介导的细胞凋亡的作用, 并且这种抑制作用与NS5A与p53结合能力的有关. 另外, HCV NS5A在细胞内和与p53激活有重要作用的hTAF(II)32有相互作用并在细胞内的定位相同. 这些结果显示HCV NS5A在细胞质与p53和hTAF(II)32有相互作用并部分抑制其功能, 并且抑制p53介导的对转录的反式激活作用和细胞凋亡作用, 可能对HCV感染的致瘤作用有重要意义.

Polyak et al[18]研究发现, NS5A在人细胞内的表达诱导白介素8(IL-8) mRNA和蛋白的产生, 并且这种效用与在体外检测到的抑制IFN的抗病毒作用有关. NS5A诱导由IL-8启动子诱导的报告基因的复制, 并且IL-8启动子的最初的133 bp是NS5A反式激活作用所必须的最小范围. NS5A-δN110和NS5A-δN222刺激IL-8启动子的产生比NS5A全蛋白水平更高. 另外, IL-8启动子的诱发突变提示NF-κB和AP-1对NS5A-δN222反式激活肿瘤坏死因子α有重要意义, 并且NF-IL-6抑制这种作用. 还有研究发现NS5A可以通过抑制细胞内IFN诱导的PKR蛋白激酶的活性对抗IFN的抗病毒作用[19,20]. 上述说明NS5A可通过多种机制抑制IFN的抗病毒作用, 并提供了NS5A蛋白复制作用的生物学效应的第一手证据. 在HCV感染时, 病毒蛋白可能诱导趋化因子的产生并对HCV对抗病毒药的抵抗作用和致病机制有作用.

总之, NS5A是HCV基因组编码的一种具有反式激活作用等多种生物学活性的非结构蛋白质. NS5A片段转录激活作用最强的位点定位于2135和2331位氨基酸残基之间. 通过反式激活作用, NS5A可激活核转录因子NF-κB及STAT3, 抑制细胞周期调节基因p21WAF1的表达, 抑制p53介导的对转录的反式激活作用和细胞凋亡作用, 通过多种机制抑制IFN的抗病毒作用, 对于HCV感染的靶细胞的细胞周期与细胞凋亡的分子生物学调节机制密切相关, 决定部分HCV病毒株对于INF-α治疗的疗效应答, 对于HCV在宿主体内的存活及宿主细胞的癌变有重要意义.

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