0 引言
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)的感染是急、慢性肝病的主要致病因素之一, 他的感染通常是亚临床的, 或只出现轻微的症状, 但大约80%的患者难以清除病毒, 发展为慢性感染, 从而更易演变为肝硬化和肝细胞肝癌, 目前世界范围都大约有1.7亿人口感染了HCV[1], 由于其高流行性、隐匿的病程和持续感染的诊断不足使得其成为严重的医学和社会经济学问题. 病毒基因组约在10 a以前就被鉴定出来, 并且引起了对HCV基因结构、病毒蛋白结构和生化特征的研究. 但由于HCV基因组表现出显著的序列变异, 尤其是在E2包膜蛋白编码区的高变区, 并且在全球范围内, HCV的基因型多达30个[2]. HCV在体外自主复制水平极低, 且其唯一的可感染动物为黑猩猩, 故缺少有效的细胞培养系统和经济的小动物模型来研究HCV复制及其致病机制, 使得对于病毒生活周期和抗病毒药物的研究进展缓慢．研究者们进行了大量的尝试来克服这个困难, 直到1999年, 才有了突破性的进展: 建立了一个有效的细胞培养模型-复制子(replicon)系统, 这个系统的基础是: 使用基因工程构建的亚基因组的HCV RNA在转染的人肝癌细胞系Huh-7细胞中可以自主复制[3-5]. 本文对于HCV细胞培养系统及其应用进行阐述．
1 丙型肝炎病毒
HCV为单股正链RNA病毒, 属于黄病毒属. HCV基因组全长约9.6 kb, 含有: (1)一个大的开放阅读框(ORF), 编码约3 010氨基酸长的多聚蛋白前体, 这个蛋白前体通过宿主和病毒蛋白酶的裂解作用产生至少10个蛋白, 排列如下: 氨基端(NH2)-核心蛋白(core)-包膜蛋白1(envelope, E1)-E2-p7-非结构蛋白2(nonstructural protein 2, NS2)-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-羧基端(COOH)[6]．这些病毒蛋白并不仅在病毒复制中起作用, 也影响宿主细胞内多种功能．(2)基因组5'-端为5'-非翻译区(NTR), 全长341个核苷酸(nt)[7], 位于ORF的上游, 在5'-NTR中存在一个内部核糖体进入位点(IRES), 他是一种最复杂的顺式激活元件, 指导核糖体40 S亚基与ORF的起始密码子AUG相结合, 从而指导ORF的翻译, 最近一些研究表明其还具有调节HCV RNA复制的作用[8]. (3)ORF下游是3'-NTR: 其长度是可变的, 包括三个结构: 一个短的约40个nt的可变序列, 其后有终止密码子, 他对于HCV基因组的复制并不是必需的[9] ; 大约30-150 nt的多聚poly(U/UC)序列; 大约98 nt的高度保守的"X尾"异源多聚序列, 其3'-末端有一个46 nt的序列可形成稳定的茎-环(stem-loop) 结构, 他对于体内及细胞培养系统的RNA复制来说是必需的．NS5B蛋白为RNA依赖的RNA多聚酶(RNA-dependent RNA polymerase, RDRP), 由于其缺少校读功能, 使得HCV RNA突变率高达每年5×10-3/位点, 从而导致一个相当大的准种池(pool of quasispecies)[10]．
HCV不是逆转录病毒, 其复制过程并不与人类免疫缺陷病毒(HIV)那样先逆转录为DNA. HCV复制的简单过程可以描述为: (1)黏附和穿入宿主细胞; (2)释放病毒正链RNA; (3)ORF的翻译和多聚蛋白的加工; (4)包含了至少NS3-5B, 很有可能还有细胞内蛋白的复制酶复合物的装配; (5)通过中间产物(负链RNA)产生正链RNA子代; (6)新的病毒颗粒的形成, 通常通过胞质内质网的出芽来获得其包膜蛋白; (7)病毒子代的释放, 可能是通过高尔基体进行运输. 所有这些步骤都发生于胞质内, 并且在胞质内可以发现HCV蛋白与细胞内膜紧密相关[11]．
2 丙型肝炎病毒复制子
丙型肝炎复制子系统是由德国美因兹Johanes-Gutenberg大学的病毒研究所的Bartenschlager et al建立的.Bartenschlager及其小组[12]于1999年从感染患者的肝脏组织中分离出HCV基因组, 并对其克隆进行重新构建, 剪切掉一部分片段, 又增加了新的片段, 包括一个抗生素耐受基因, 并将其转染入人肝癌细胞系Huh-7中, 通过在含有硫酸新霉素(G418)的培养基中培养后, 可以获得G418耐受的细胞克隆, 这些细胞克隆可以持续的表达HCV复制子RNA, 从而建立了有效复制的HCV细胞培养系统, 但其复制效率较低, 平均106个细胞中只有一个是合乎要求的. 美国华盛顿大学医学院分子微生物学系的Blight 和纽约Rockefeller大学丙型肝炎研究中心的Rice et al在此基础上改进了这个系统, 寻找能够使复制子更加有效复制的突变株, 他们发现了称为S1179I的变异株, 感染了存在此种突变的复制子宿主细胞10个中就有1个可以产生足够多的病毒蛋白, 使得研究者在短时间内进行基因研究, 而不用依赖于繁锁的细胞选择技术[13]．
复制子的基本结构包含: (1)带有HCV 5'-NTR和部分编码核心蛋白区域(核苷酸342到377/389); (2)新霉素磷酸转移酶基因(neoR), 他的表达可以产生对G418的耐受; (3)来自于鼠脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES(E-I), 他指导HCV非结构蛋白的翻译; (4)HCV RNA非结构蛋白编码区(NS2/NS3到NS5B); (5) 3'- NTR[14]. 其中位于5'-NTR的HCV IRES指导的第一个顺反子(neoR)的翻译, EMCV IRES指导的第二个顺反子(NS3-5B)的翻译．HCV IRES上游的序列对于RNA复制来说是必需的; HCV 5'-NTR头125个核苷酸对于RNA复制来说已经足够, 但这种复制子的增生会受到严重损害; 高水平的RNA复制需要位于IRES内的序列[15]. 在 NS5A区的干扰素敏感决定区(ISDR)和蛋白激酶R(PKR)结合位点附近的一个小结构域内可产生多种适应性突变, 从而增加复制子的复制效率[16]．
丙型肝炎复制子的基本功能是其在Huh-7细胞系中可以自主复制, 产生较高水平的HCV RNA, 并且由于复制子中携带有耐新霉素的基因, 故其可以在含有新霉素的培养系统中被选择出来. 许多研究者发现了可以使复制效率更加有效的适应性突变株, 特别是在NS5B区的单个氨基酸的置换, 使得复制子的克隆形成能力增加了至少1 000倍. Ikeda et al[17]报道了来自于HCV-N序列的复制子并不需要适应性突变就可以具有较高的克隆形成能力, 其原因是这种序列较其他的ISDR区多了4个氨基酸的插入. 这些系统的RNA含量高, 甚至可以使用Northern印迹法或使用3H-尿嘧啶的代谢性放射标记法进行检测, 使得研究者有足够多的条件来对HCV进行分子病毒学的研究[18,19]．
Pietschmann et al[20]报道了含有复制子的细胞的特点: (1)在含有复制子的细胞内缺少细胞毒性效应. HCV RNA的复制依赖于细胞的生长, 而且没有超微结构的改变或是生长属性的改变, 提示了HCV RNA以及病毒NS3-5B蛋白并无细胞毒性, 肝脏的损伤是由抗病毒的免疫反应所引起的. (2)HCV复制子在G418存在的条件下的稳定性. 复制子可以在连续的选择压力条件下稳定在细胞内传代, 而当一定的时间过去后, 即使去除选择性条件, HCV复制子RNA也可以达到一个很明显的水平, 这些结果说明含有HCV复制子的细胞可以很好的反应出体内病毒的持续感染. (3)细胞生长对HCV RNA复制的影响. 宿主的细胞因子活性和数量对于RNA复制、翻译是必须的．
3 丙型肝炎病毒复制子的应用
3.1 复制子对于研究HCV复制过程的应用
HCV RNA复制的详细机制尚不清楚, 由于复制子的出现, 使得许多研究得以进行, 获得了大量有价值的资料, 并且丰富了对于HCV RNA的了解. HCV感染宿主细胞后, 可以引起宿主细胞的抗病毒反应, 部分是通过病毒双链RNA(dsRNA)复制产物的积蓄所引起的. dsRNA提供了激活特异性转录因子(包括NFκB, IFR-1和IRF-3)的直接的信号, 这就刺激了宿主抗病毒和抗增生基因的产生及表达. IFNγ、IRF-1的激活被认为通过一个PKR依赖的途径进行的[21], PKR确实是一个上游的IRF-1激活信号的转导物, 在感染期间, PKR启动了一个dsRNA介导的信号层叠并且导致了IRF-1的磷酸化以及IRF-1的DNA结合功能的激活. 激活的IRF-1在干扰素刺激反应启动子元件(IFN-stimulated response promoter element, ISRE)内与IRF-E结合并参与了细胞基因(间接刺激适应性免疫反应来抑制病毒复制)的反应．不同的研究显示IRF-1的DNA结合活性和反式激活功能是由PKR为信号, 磷酸化直接指导的, 如Hiscott et al[22]证实了在IRF-1中的两串调节性磷酸化位点也影响其反式激活功能, Rahat et al [23]阐述了磷酸化介导了IRF-1的DNA结合活性及其对HLA-DRα的反式激活活性．
值得注意的, E2蛋白的表达, 曾被描述为一个PKR抑制子, 其实并不影响IRF-1的激活. 与这个发现相一致的是, 发现了E2并不阻断体内细胞的dsRNA介导的PKR的激活. 这可能是由于E2在内质网内腔的持续存在或者E2不同的糖基化抑制了其与PKR的相互作用, 或者说E2可以调节PKR而独立于dsRNA和IRF-1[24]. dsRNA信号的阻断定位于病毒NS5A蛋白, NS5A蛋白是丝氨酸残基在一种未知的细胞激酶作用下磷酸化的产物. NS5A磷酸化至少有两种确定的形式, p56(基础磷酸化形式)和p58(超磷酸化形式). NS5A可以与干扰素介导的、dsRNA激活的PKR相互作用, 从而调整IFN刺激的抗病毒反应, 他在HCV复制期间使PKR局部化并抑制PKR对于dsRNA的激活. 在NS5A的PKR结合域内或邻近的突变解除了对于IRF-1调节途径的抑制, 导致了IRF-1依赖的抗病毒效应器基因的反应和与之伴随的HCV RNA复制效率的下降. 提示了NS5A通过阻止IRF-1的激活以及破坏宿主抗病毒途径影响了HCV的持续感染.在NS5A区明显集中的突变提示了NS5A对于体外HCV复制的建立是非常重要的. 一个可能性就是NS5A介导了宿主蛋白抑制HCV复制的互相作用. 在NS5A区的突变也许中断了这种互相作用, 破坏IRF-1的激活, 并且通过PKR影响宿主基因表达, 因此使得HCV得以持续复制．
HCV RNA复制可以触发细胞内基因的表达和激活启动子, 这依赖于IRF-1和NS5A, 尽管NS5A抑制PKR, 也可以抑制IRF-1依赖的基因表达(包括IFNα和IFNβ基因). 最近的研究表明IRF-1与IRF-3和IFR-7互相协作来对一定范围内的抗病毒反应进行的调节, 创造更加合适的细胞环境来保持HCV的复制．
3.2 复制子对于研究、发展抗病毒药物的应用
对于HCV感染, 唯一的抗病毒方案为干扰素或与利巴韦林联合使用, 但是其持续显效率并不高, 在前者为10-20%, 后者为30-40%, 对于不显效的患者, 尚无替代的疗法．而HCV复制子系统的出现对于发展和评估抗病毒药物也非常有用[25]. 首先, 众所周知, 抗病毒治疗的初始靶位点是: (1)病毒蛋白NS2/3和NS3(与NS4A)的处理过程; (2)使用NS3解旋酶和NS5B RDRP的病毒RNA的复制过程; (3)病毒调节元件, 如5'-UTR和3'-UTR[26]. 其中绝大部分可以在复制子中编码, 并且他们对于复制也是必需的. (a)复制子可以在细胞中稳定的复制. (b)细胞可以适应不同的培养形式, 如96孔板等. (c)通过使用一个高度的细胞培养适应性复制子, 可以建立细胞系, 并使之携带选择性的HCV RNA亚基因组(带有可以很容易检测到的标记基因)．
由于HCV存在较大的变异, 以及由此引起的耐药, 所以针对不同靶位点的联合抗病毒治疗是非常重要的. 目前大量的研究都是可以使用复制子系统来进行的. Guo et al[27]报道了亚基因复制子对于IFNα敏感, 并且可以将其半衰期减少为12 h. Frese et al[28,29]证实了IFNα对于HCV复制的抑制并不依赖于MxA蛋白(Mx蛋白为高度保守的、大的GTP酶, 人MxA蛋白在某些病毒中具有抗正、负链RNA的作用), 并研究了IFNγ对于病毒蛋白合成及RNA复制的抑制作用, 他们发现: (1)IFNγ抑制HCV蛋白的积聚. (2)IFNγ抑制HCV RNA的积聚. (3)IFNγ对于HCV复制子的抑制并不是通过后来的I型IFN的产生所介导的. (4)HCV复制子耐受一氧化氮(NO)浓度的增加. (5)HCV复制子的抑制并不是由色氨酸的消耗所介导的. 从而得出结论: IFNγ对于HCV的控制有着重要的作用. NK细胞、细胞毒性T细胞和其他的免疫细胞清除HCV并不仅仅是通过直接清除感染的肝细胞, 也通过产生IFNγ来发挥抗病毒作用. 这个结论使得抗病毒治疗出现了新的途径．
虽然在此方面有了许多进展, 但系统的一些属性必须考虑: (1)既然HCV RNA的复制与宿主细胞的增生相耦联, 抑制宿主细胞生长的复合物也会减少复制子RNA的水平. 因此, 只有当细胞毒性或细胞抑制的效应被排除后, 才可以得出其特异性抑制HCV复制的结论. (2)并不能排除结构蛋白对复合物抗病毒效果或对抗病毒耐受的影响. 通过亚基因组的复制子的药物筛选实验的抑制性药物也应该对具有自主复制能力的全长HCV基因组的细胞系有效. 尽管使用这样细胞系的初始筛选是可以的, 但当使用全长HCV基因组时需要更加高的生物安全性也使得这种药物筛选方法有了限制. (3)细胞培养适应性突变也可以改变蛋白的生物化学属性使之对抗病毒药的敏感性产生变化. 研究者发现了在大约20种携带复制子的不同的细胞系都带有一个不同的细胞培养适应性突变. 因此为了寻找抑制NS5B RDRP, 可以使用不仅是在NS5B区适应性突变的细胞系来进行实验[30]．
4 丙型肝炎病毒复制子的前景
HCV复制子系统的产生研究者有了很好的HCV研究工具, 但尽管有这个进步, 对于细胞培养系统的进一步优化还需要大量的工作. 例如, 直到现在, 只有Huh-7细胞支持HCV RNA的复制, 而对于其他的细胞系的感染, 包括HCV可以感染的细胞(如HepG2或PH5CH)等的尝试都失败了. 这也许与Huh-7宿主细胞因素的构成不同于其他细胞系有关. 另一个困难是, 虽然目前已可以将全长HCV基因组构建入复制子系统中, 但HCV复制子系统所产生的HCV RNA均不具有感染性, 因此现在的HCV复制子系统只能用于研究HCV复制的机制, 而不能用于研究其如何来感染宿主细胞的机制. 最后, 我们需要的仍然是一个可以有效的产生感染性HCV的系统和一个可以得到的细胞系. 虽然现在我们还不能预言还需多长时间才能得到这样的系统, 但是最近几年的研究还可以使我们很乐观的认为这将出现在不远的将来．
