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世界华人消化杂志. 2003-07-15; 11(7): 1008-1011
在线出版日期: 2003-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i7.1008
乙型肝炎病毒增强子的结构和调控研究
王建军, 成军, 刘妍, 张忠东, 杨倩, 杨艳杰
王建军, 成军, 刘妍, 张忠东, 杨倩, 杨艳杰, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市 100039
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetheray.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-01-11
修回日期: 2003-01-20
接受日期: 2003-02-16
在线出版日期: 2003-07-15

N/A

关键词: N/A
引文著录: 王建军, 成军, 刘妍, 张忠东, 杨倩, 杨艳杰. 乙型肝炎病毒增强子的结构和调控研究. 世界华人消化杂志 2003; 11(7): 1008-1011
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: January 11, 2003
Revised: January 20, 2003
Accepted: February 16, 2003
Published online: July 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

HBV属嗜肝DNA病毒, 其基因组为3.2 kb部分双链的环状DNA. 他的复制需要一个RNA中间物-前基因组RNA, 经过反转录产生新的DNA分子. HBV基因组的功能单位十分密集, 高度压缩, 重复利用. 目前已确定有四个主要的开放阅读框架, 分别负责编码核心抗原(pre-C/C)、核酸聚合酶(P)、表面抗原(preS/S)和X蛋白(X). 这些基因的表达受到顺式元件-启动子和增强子的调控. 目前在HBV基因组已发现并鉴定的顺式元件有四个启动子(C、X、SPⅠ、SPⅡ)、两个增强子(EnhⅠ和EnhⅡ)和糖皮质激素应答元件[1-4]. 其中增强子的作用主要是调控HBV的转录和复制.

1 HBV增强子的结构

增强子是指能使他连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列, 其增强作用相对不依赖于他的位置、方向以及与目标启动子的距离, 无基因专一性, 可在不同基因组合中表现增强效应. 其功能主要是通过与调节蛋白相互作用刺激特定的一个或一组基因的基础转录活性. 增强子常由一个或多个连续或不连续的DNA序列元件组成, 并与特异的蛋白质相互作用. 这些DNA结合蛋白可由病毒本身编码, 也可由宿主细胞编码. HBV的两个增强子分别为EnhⅠ和EnhⅡ.

EnhⅠ在S基因和X基因之间, 大约在1070-1234 nt前后加减100 bp的区段, 实际只需50个核苷酸的短小序列, 即可保持其主要功能. EnhⅠ定位在P基因中, 末端与X基因启动子重叠. 可增强C、SPⅠ、SPⅡ和X启动子的转录, 但效率不同, 如对下游的C启动子比对X启动子的增强作用高60倍. EnhⅠ对启动子的作用不是直接的, 而是通过与EnhⅡ的协同作用[5]. EnhⅡ大约在1627-1774 nt, 定位在X基因中, 末端含CP, 可分为EnhⅡ-A和EnhⅡ-B两部分. A部分是正调节元件, 主要参与EnhⅡ的肝细胞专一性, 而B片段是EnhⅡ的活性单位, 前者必需与后者协同作用才有活性. B部分有60-70%的EnhⅡ活性, 又可分为B1(1687-1705 nt)、B2(1706-1736 nt)和B3(1737-1774 nt)三个亚区. 前两部分是主要功能区, B2是主要转录因子的结合位点[6].

2 HBV增强子的调控研究

许多因子通过调控HBV Enh活性进而调控HBV在体内的转录与复制, 其机制主要是直接作用于Enh上的相应的结合位点, 也有一些因子作用机制主要是通过反式激活作用. HBV Enh自身基因结构的突变对HBV Enh的活性也有一定影响. HBV Enh的调控研究对于了解HBV在体内转录及复制调控机制, HBV感染的致病机制和抗病毒药物的研发有重要意义.

2.1 可上调HBV增强子的因子

Waris et al[7]研究发现, 信号转导子及转录激活子(STAT)蛋白家族中的STAT3和HNF-3的相互作用可引起HBV EnhⅠ功能激活. STAT-3与许多转录调控因子有关并调控与细胞因子有关的基因表达. 虽然其功能与他的核苷酸序列有关, 近来发现其在发生了DNA缺失后可与其他转录因子发生相互作用. STAT-3结合位点定位于HBV EnhⅠ核心区域. 白介素6(IL-6)和表皮生长因子可刺激HBV EnhⅠ的DNA-STAT-3相互作用, 导致HBV EnhⅠ表现完全的激活作用和病毒基因的表达.应用瞬时转染的方法, 上述作用得到证实. 还有人发现IL-6通过单信号转导的方式, 间接通过他的转录因子NF-IL-6上调EnhⅠ活性[8].Wang et al[9]研究还发现HNF1与EnhⅡB2位点结合, 可以上调EnhⅡ活性.

Raney et al[10]研究发现过氧化物酶体增生物(PPAR)可通过HBV基因组EnhⅠ区域的核激素受体识别位点直接增强病毒的转录作用. 实验发现: 一种转基因小鼠的HBV核酸启动子突变(A1 764T加G1 766A)的可以抑制视黄醛受体α(RXR-α)和PPAR-α异二聚体结合近端的核激素受体识别序列.在这些发生突变的转基因鼠中, PPAR使肝内病毒转录和复制的增加并没有受病毒核酸启动子的突变影响. 这表明过PPAR可通过HBV基因组EnhⅠ区域的核激素受体识别位点直接以PPAR-α方式增强病毒的转录作用.

SP1有两个结合位点在核心启动子, 一个在他的调控元件上游, 也被叫做EnhⅡ增强子. Li et al[11]研究发现, 在EnhⅡ增强子的SP1结合位点(SP1-3)可以正向调节所有HBV基因的表达. 当他通过突变被去掉后, 所有HBV基因的表达被抑制. 然而, 如果在核心启动子的两个SP1位点也被去除了, Sp1-3突变对S基因和X基因的抑制作用将消失. 这些结果提示SP1既可以作为HBV基因表达的阳性调节因子, 也可以作为阴性调节因子. 这种二重作用对于调节HBV基因的表达非常重要. Ishida et al[12]研究发现, 多重转录因子HLF, FTF, 可调控HBV EnhⅡ, 激活HBV的转录作用. HBV Enh II活性必需的重要的区域为1640-1663 nt. 应用酵母单杂交技术从人肝cDNA文库筛选与本区域相关的因子HLF, FTF, 所有这些因子与1640 -1663 nt序列有亲和性. 关于这些因子调控转录方面的研究显示HLF和FTF对1640-1663 nt有刺激活性. 在瞬时转染HBV表达载体体系, FTF可同时激活转录3.5 kb的RNA和2.4/2.1 kb的RNA. HLF仅转录. 5 kb的RNA.应用引物延伸分析, HLF强烈刺激前基因组RNA的合成, 较前C区RNA明显. FTF刺激EnhⅡ活性, 而HLF激活仅调节核心启动子的核心上游调节序列, 对前基因组RNA的合成有决定性的作用.

一些因子通过反式激活作用也可以上调增强子活性. Lee et al[13]研究发现, 通过人肝细胞Enh I的E因子的AP1位点, 人乳头瘤病毒16型EP6蛋白(HPV-16 E6)和HBV X蛋白对HBV前基因组有反式激活作用. 提示HPV-16可以增强HBV和其他启动子含有AP1位点的癌基因的转录活性. HBx反式激活Enh I对全基因组或亚基因组启动子控制下的转录; 而Enh I又增强了反式激活的易感性. Kwon et al[14]研究发现, HBV核心蛋白通过核因子κB(NF-κB)结合位点(GGGACGTACT, 核酸序列1408-1417) 激活HBV EnhⅡ. 通过反式激活作用激活EnhⅡ/前基因组启动子, 促进HBV DNA转化的还有HBV X蛋白和CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)[15].

2.2 可下调HBV增强子的因子

Sun et al[16]研究发现一种阴性调节因子(NRE)定位于HBV核心启动子调节序列的上游和EnhⅡ, 并抑制这两个部分的转录和复制. 通过表达克隆化得到阴性调节蛋白(NREBP), 发现内源性的NREBP定位于人肿瘤细胞HuH-7细胞的细胞核. NREBP蛋白抗体可以特异性的阻断NRE活性, 提示NREBP为与NRE序列关联的内源性蛋白. 通过PCR辅助结合位点的方法, 发现NREBP的共有序列为GA(G/T)AN(C/G)(A/G)CC. NREBP的过表达通过NRE可增强对HBV核心启动子的抑制作用.

Lee et al[17,18]研究发现p53抑制HBV Enh/X启动子活性. 同时还通过抑制EnhⅡ抑制核心启动子转录活性. HBx可对抗这种作用. Lai et al[19]研究发现E4BP4通过结合位点阻断的机制抑制EnhⅡ/CP活性, 进而抑制HBV DNA的转录.

某些抗病毒、免疫抑制药物通过抑制HBV增强子起到抑制HBV复制和转录的作用. IFN-α通过抑制EnhⅠ活性抑制HBV表达[20], IFN-α诱导转录因子, 干诱导基因因子3(ISGF3)和干扰素调节因子1(IRF-1)通过与基因启动子为"AGTTTCNNTTTCNC"的干扰素激活反应元件(ISRE)结合激活干扰素诱导基因的表达. Nakao et al[21]研究发现p48(ISGF3-β)参与IFN-α诱导的抑制HBV EnhⅠ活性. HBV EnhⅠ有ISRE类似序列"AGGCTTTCACTTTCTC". 从HuH-7细胞提取结合了这个序列的提取物用IFN-α处理后仅包含p48. 在细胞转染中, IFN-α抑制HBV EnhⅠ活性, 过表达的p48提高这种抑制作用. HBV EnhⅠ的这种ISRE类似序列的突变或缺失都可以降低IFN-α的抑制作用. HBV EnhⅠ的SRE类似序列与p48蛋白相互作用, 介导IFN-α诱导的对增强子活性的抑制作用. 然而, Schulte-Frohlinde et al[22]研究发现IFN诱导的抑制作用不依赖与HBV-EnhⅠ的存在而是由于ISRE类似序列的作用. Lee et al[23]研究发现, T细胞核因子(NFAT1-C)通过其的应答位点GGAGA和使HBx-driven失去转录活性抑制HBV EnhⅡ/Cp活性. 敏感的NFAT1免疫抑制药物环孢素A(CsA)是在免疫反应中细胞因子和病毒基因的转录调节因子. 通过分析一系列缺失突变和异种启动子的检测, 发现CsA敏感的NFAT1-C通过NFAT1-C的应答位点(GGAGA, nt 1603-1618)和以剂量依赖方式使HBx失去转录活性抑制EnhⅡ/Cp的转录活性. 这些结果表明CsA敏感性NFAT1-C可以通过抑制HBV EnhⅡ/Cp转录活性来控制HBV感染细胞的活动.

David-Cordonnier et al[24]发现: c-Myb蛋白与HBV Enh EP相关并且与NF-M协同调控转录. EP因子为HBV增强子中的活性结构, 他的一个15 bp的位点由于受其他功能位点如E位点调控而非常重要. EP因子可能包括两个结合c-myb基因家族产物的位点. DNase I阻遏物实验提示只有一个结合位点有保护作用. 通过造血细胞(K562)和肝细胞系(HepG2)的CAT测定发现c-Myb基因可下调HBV Enh的转录活性. c-Myb和可以识别HBV Enh E因子的C/EBP β的同源物质NF-M的共同表达对HBV Enh有协同的抑制作用, 并且他们每一个对感染HBV的HepG2和K562细胞系的转录单独都有抑制作用.

2.3 基因突变引起HBV增强子活性的改变

HBV Enh某些位点的基因突变可引起增强子活性的改变. Xie et al [25]研究了HBV EnhⅡB1因子位点专一突变对病毒转录和复制的影响. HBV EnhⅡ有高度的肝脏专一性并且对调节所有HBV基因的转录有重要作用. HBV EnhⅡ主要的功能位点B1FB1F结合位点缺失时, 在EⅡ-CAT报告质粒中HBV EnhⅡ的活性显著降低. 此外, B1因子的点突变使B1F结合失败可明显降低起始与HBV核心启动子的病毒基因的转录, 结果导致HBV e抗原、前基因组RNA和病毒复制的模板DNA产量减少. 因此, B1F与其在EⅡ区域上的靶序列的相互作用对HBV的复制和转录十分重要.

Honda et al[26]研究检测了与引起严重肝损害的有关区域的突变. 在严重的HBV感染病例中, 大约50%的核苷酸变异定位于在全长1741-1777(EnhⅡ/C启动子区域的14.2%)区域内, 30%的X蛋白的氨基酸变异定位于包含122-132 (X蛋白的7.1%)密码子的区域. 除了在前C区和C区的变异之外, 在EnhⅡ/C启动子和X蛋白区域的变异对严重的HBV感染的发病机制有关. Honda et al[27]研究亦得到了类似的结果.

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