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世界华人消化杂志. 2003-07-15; 11(7): 1004-1006
在线出版日期: 2003-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i7.1004
乙肝病毒表面抗原基因启动子II的结构及调节研究
梁耀东, 成军, 陆荫英, 吴君, 程明亮
梁耀东, 成军, 陆荫英, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市 100039
吴君, 程明亮, 贵阳医学院第一附属医院感染科贵州省贵阳市 550004
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetheray.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-01-11
修回日期: 2003-01-20
接受日期: 2003-02-16
在线出版日期: 2003-07-15

N/A

关键词: N/A
引文著录: 梁耀东, 成军, 陆荫英, 吴君, 程明亮. 乙肝病毒表面抗原基因启动子II的结构及调节研究. 世界华人消化杂志 2003; 11(7): 1004-1006
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: January 11, 2003
Revised: January 20, 2003
Accepted: February 16, 2003
Published online: July 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)为含有一段单股区的双链环状DNA病毒, 属嗜肝DNA病毒科, 其基因组结构紧密, 可分为结构基因序列和调节基因序列两部分, 二者可具有相互重叠的特点. HBV基因的负链核苷酸序列中, 至少有4个开放读码框(open reading frame, ORF), 包括编码外膜蛋白的S基因区, 编码核衣壳蛋白的C基因区, 编码聚合酶的P基因区和调节病毒基因转录水平的X基因区, 4种ORF分别有各自的启动子. HBV的外膜蛋白能使病毒由感染的细胞分泌, 并能附着和侵入新的细胞; 同时其也是引起宿主保护性应答的免疫原表位[1-6]. 因此, 作为指导S 基因组RNA转录的SP启动子序列, 在HBV的生活周期中, 具有较为重要的作用.

1 HBVSP-II启动子的结构特点

启动子(promotor)又称启动基因, 是DNA分子上可与RNA聚合酶特异结合, 而使转录开始的一段DNA序列, 位于转录起始点上游, 由RNA聚合酶结合部位及控制转录的调节组件构成. HBV至少有4个启动子, 转录出3.5 kb、2.4 kb、2.1 kb和0.7 kb mRNA等, 这4条RNA 均有一个共同的多聚腺苷酸(PolyA)尾, 在此终止转录. S基因有两个串联的启动子, SP-I启动子(2219-2780 nt)调节2.4 kb的mRNA转录, 编码大蛋白; SP-II启动子(2 809-3 152 nt)调节2.1 kb的mRNA转录, 编码中蛋白和主蛋白. SPII启动子不含典型的TATA盒, 但含不典型的TATA样序列(-25~-32 nt), 有启动子的特异活性, 可与胞核提取物特异结合. SP-II启动子与猴病毒40(SV40) 晚期启动子相类似, 富含鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)核苷酸, 对其进行精细的突变分析表明, 位于RNA转录起始位点上游200个核苷酸内的SP-II启动子可分为A至G, 7个区段, 其均能通过与序列特异性的DNA结合蛋白相互作用而影响转录水平, 其中-188~-68远端的A、B和C区是正调控区, 如果同时去除A、B和C区可使转录水平下降3倍, 但仅有B和C区均可保持较高水平; 位于-6~-49的D区是SPII启动子的必需元件, 与SV40复制起点有一定程度的同源性; E-G区位于主要转录起始位点的45个核苷酸内, 与SV40主要晚期启动子有序列同源性, E区可抑制F区对转录的负调节, 并可补偿G区的突变对转录的影响, 而删除F区后, G区可补偿E区的缺失对转录的影响. 总之, SPII启动子至少有6个负责正调节的转录因子结合位点(A-E、G)和一个负调节的转录因子结合位点(F)[7-10].

2 HBVSP-II启动子的调节

S基因的三种蛋白的主要功能是以一定的比例在内质网内与核心颗粒一起装配成成熟的病毒颗粒, 再分泌到细胞外. 中、主蛋白在没有其他病毒颗粒时, 可以小球型或丝状的亚病毒颗粒形式分泌, 而大蛋白则不能单独分泌. 当大蛋白与其他表面蛋白一起表达时, 病毒颗粒是否能组装并分泌取决于大蛋白的数量; 当大蛋白数量相对少时, 病毒颗粒成熟并分泌; 而当大蛋白数量多时, 抑制病毒颗粒的组装与分泌. 因此, 在HBV感染中, 大蛋白的含量明显低于中蛋白和主蛋白, 这是通过两个独立的启动子SP-I及SP-II来调节的; 上游是SP-I启动子, 主要控制大蛋白的转录与翻译, 下游的SP-II启动子主要控制中、主蛋白的转录与翻译. 通常前-S1 mRNA的量远少于S mRNA, 因此大蛋白的量通常不足以阻止病毒成熟和分泌. 由于大蛋白的增加易导致病毒包膜蛋白在宿主内蓄积, 引起细胞病变效应, 因此, HBV膜蛋白的这种比例不仅有利于感染性HBV颗粒的成熟与释放, 而且也有利于宿主细胞的生存.

SP-II启动子中含CCAAT短序列, 是一种调节外膜蛋白正常比率的重要因素. CCAAT序列既能增强SP-II启动子的活性, 又能阻断2.4 kb mRNA转录延伸作用, 致使2.4 kb mRNA 表达受限制. Lu et al[11]发现在SP-II启动子内的CCAAT元件不仅能增加S基因的转录, 而且能降低前-S1基因的转录各5倍, 从而维持大/主蛋白<1/5的正常比例, 因此, 在CCAAT元件发生突变时, 大蛋白产生过量, 可抑制毒粒排出, 将导致细胞内表面蛋白分泌减少而大量堆积, 从而影响HBV 的装配. 所以, CCAAT元件在病毒的生活史中对维持S/前-S1基因转录的比例起到关键的作用. SP-II启动子发生缺失变异时, 大蛋白将过度表达, 而中、主蛋白表达减少, 因而病毒及亚病毒颗粒的分泌受到抑制, 但对病毒复制能力无影响, 肝细胞内大蛋白及复制中间产物cccDNA等堆积对肝细胞有细胞毒作用, 能增强肝细胞对炎症细胞因子的敏感性, 使肝细胞受损, 可能是慢性乙型肝炎肝细胞毛玻璃样变性的原因之一[12,13]. 进一步研究发现, 过度表达的大蛋白在肝细胞内质网通过激活grp78和grp94启动子, 改变宿主细胞的生理功能. 转基因小鼠模型也已经证实, 若大蛋白过度表达, 在肝细胞堆积, 将导致肝细胞内质网肿胀、肝细胞变性. 另一些研究观察了大、中、主蛋白比例变化与肝损害之间的关系, 发现在急性肝炎恢复期的患者, 存在正常比例的大、中、主蛋白; 而慢性肝炎患者的大蛋白比例增高, 中蛋白合成减少. 因此, 在感染过程中改变大、中、主蛋白的比例将影响疾病的过程.

Bock et al [14-16]从前-S区突变去研究SP-II启动子的转录调控后发现, 当前S2区发生CCAAT盒点突变(MUT1)、CCAAT盒的3'第6 bp缺失(MUT2)及CCAAT盒的3'第153 bp缺失(MUT3)变异时, SP-II启动子功能下降约30-75%, 并且发现, SP-II启动子及MUT3能被CCAAT盒结合因子(CBF)调控, 而MUT1及MUT2则不被CBF调控, 可见 CBF是SP-II启动子发挥作用所需, CCAAT盒和另一未知区域所介导的启动子的功能必需通过CBF而起作用. 当发生MUT1和MUT2或MUT3时, 大蛋白将贮留在细胞内质网中, 核心蛋白将贮留在胞核内, MUT3突变时, 出现有煎蛋样和螺旋丝状物质的畸形病毒颗粒; 并且还发现前-S区的不同区域决定着病毒在细胞内的定位和细胞外的表观, 前-S区变异可能与HBV相关肝病的进展和预后有关. Ha-Lee et al[17]研究发现, SP-II启动子的突变, 使基因表达失衡, 是慢性乙肝患者持续感染得以维持的一种途径. 有研究证实位于前S-ORF内的2995-3177 nt的缺失突变减弱了前-S的免疫原性, 但仍存在与肝细胞的结合位点, 不但保留了病毒感染肝细胞的能力, 还能使病毒避开宿主的免疫攻击, 导致HBV的持续携带状态.

Kajiya et al[18]在慢性乙肝病毒感染过程中研究发现, 当机体的免疫反应强大时, HBV病毒基因突变由通常的核心启动子(CP)突变(T(1762)A(1764))及前-S1区缺失变为核心启动子(CP)突变及SP-II启动子区发生缺失变异; 将其PCR产物转染入人肝细胞瘤HuH-7细胞, 发现细胞内病毒复制频率增加, 但HBsAg和HBeAg分泌减少, 细胞内不含包膜的核心颗粒增多, 提示核心启动子(CP)突变及SP-II启动子区缺失可能协同参与病情的发展.

乙型肝炎病毒的基因表达受许多转录因子的调控, 参与HBV基因组转录调节的有多种反式调节蛋白, 这些调节蛋白既包括来自病毒基因组的表达产物, 也包括来自宿主细胞的各种调节转录因子. SP-II启动子通过其-189~+1间的序列调控元件与NF1、SP1和NF-Y等转录因子结合来调控前-S2/S基因的表达. Raney et al[19]研究发现肝细胞核因子HNF3与SP-II启动子的-231~-240结合后, 前-S2/S基因的转录受到抑制. 转录激活蛋白Sp1可与SP-II启动子B、D、E、F区结合. Li etal[20]研究发现转录因子Sp1能正负调控S基因的转录, 其有三个结合位点, Sp1-1和Sp1-2在核心启动子内, Sp1-3在增强子EhnII内. Sp1-1不影响S基因的转录, Sp1-2负调控S基因, 除去Sp1-2后, Sp1-1则正调控S基因, Sp1-3正调控S基因, 当其发生突变时, 则抑制基因表达, 然而, 这种抑制作用在Sp1-1和Sp1-2也发生突变时消失, Sp1是如何具体调控S基因的转录, 有待进一步研究. SP-II启动子不含有TATA盒, 其调控前-S2/S基因转录的机制也还不完全清楚, Bogomolski-Yahalom et al[21]研究发现在SP-II启动子的-25~-32 bp的核苷酸序列有启动子的特异活性, 类似于TATA盒的功能, 含有TATA盒结合蛋白(TBP)结合位点, 可与胞核提取物特异结合; -13~-16bp的核苷酸序列为SP-II启动子的起始子(initiator, inr). 总之, 上述两种序列在前-S2/S基因转录调控中起到重要作用. 有资料表明增强子Enh1/Enh2 均能提高SP-II启动子的转录水平, 但这方面的报道较少.

总之, 基因表达调控是在多级水平上进行的, 就目前的认识, 转录水平的调控是基因的重要控制方式, 基因的转录起始是基因表达的基本调控点, 而这一阶段的重要事件是RNA聚合酶与基因启动子的相互作用, 故对基因启动子的结构及调节研究十分重要. S基因编码的主蛋白是目前常用乙型肝炎疫苗的主要中和位点, 并且S及前-S基因组与HBV病毒的成熟、分泌及感染性有关.目前, 对HBV SP启动子的结构及调节的了解还比较少, 大大限制了我们对乙肝病毒及其相关疾病的认识, 有待进一步的研究.

1.  成 军, 董 菁. 乙型肝炎病毒前基因组启动子的调节机制. 国外医学. 流行病学传染病学分册. 2002;29:15-18.  [PubMed]  [DOI]
2.  郭 晏海. 与HBV进入细胞有关的细胞膜分子. 国外医学病毒学分册. 2001;8:182-185.  [PubMed]  [DOI]
3.  De Meyer S, Gong ZJ, Suwandhi W, van Pelt J, Soumillion A, Yap SH. Organ and speciesspecificity of hepatitis B virus (HBV) infection: a review of literature with a special reference to preferential attachment of HBV to human hepatocytes. J Viral Hepat. 1997;4:145-153.  [PubMed]  [DOI]
4.  Sonveaux N, Thines D, Ruysschaert JM. Characterization ofthe HBsAg particlelipid membrane. Res Virol. 1995;146:43-51.  [PubMed]  [DOI]
5.  Mangold CM, Unckell F, Werr M, Streeck RE. Analysis of intermolecular disulfide bonds and free sulfhydryl groups in hepatitis B surface antigen particles. Arch Virol. 1997;142:2257-2267.  [PubMed]  [DOI]
6.  Xu Z, Bruss V, Yen TS. Formation of intracellular particles by hepatitis B virus large surface protein. J Virol. 1997;71:5487-5494.  [PubMed]  [DOI]
7.  成 军, 杨 守纯. 现代肝炎病毒分子生物学. 第1版. 北京: 人民军医出版社 1997; 25-43.  [PubMed]  [DOI]
8.  金 奇. 医学分子病毒学. 第1版. 北京: 科学出版社 2001; 334-335.  [PubMed]  [DOI]
9.  Alka S, Hemlata D, Vaishali C, Shahid J, Kumar PS, Hepatitis Bvirus surface(S) transactivator with DNA-binding properties.  J Med Virol. 2000;61:1-10.  [PubMed]  [DOI]
10.  De Meyer S, Depla E, Maertens G, Soumillion A, Yap SH. Characterization of small hepatitis B surface antigen epitopes involved in binding to human annexin V. J Viral Hepat. 1999;6:277285.  [PubMed]  [DOI]
11.  Lu CC, Chen M, Ou JH, Yen TS. Key role of a CCAAT element in regulating hepatitis B virus surface protein expression. Virology. 1995;206:1155-1158.  [PubMed]  [DOI]
12.  季 伟, 王 慧芬. 乙型肝炎病毒转录后调节机制的研究进展.国外医学. 流行病学传染病学分册. 2000;27:120-124.  [PubMed]  [DOI]
13.  吴 炜, 李 兰娟. HBV前S基因变异及其临床意义. 国外医学. 流行病学传染病学分册. 2002;29:200-202.  [PubMed]  [DOI]
14.  Bock CT, Kubicka S, Manns MP, Trautwein C. Two controlelements in the hepatitis B virus S-promoter are important forfull promtoteractivity mediated by CCAAT-binding factor. Hepatology. 1999;29:1236-1247.  [PubMed]  [DOI]
15.  Bock CT, Tillmann HL, Manns MP, Trautwein C. The pre-Sregion determines the intracellular localization and appearance of hepatitis B virus. Hepatology. 1999;30:517-525.  [PubMed]  [DOI]
16.  Bock CT, Tillmann HL, Maschek HJ, Manns MP, Trautwein C. A preS mutation isolated from a patient with chronic hepatitisB infection leads to virus retention and misassembly. Gastroenterology. 1997;113:1976-1982.  [PubMed]  [DOI]
17.  Ha-Lee YM, Lee J, Pyun H, Kim Y, Sohn J, Cho YJ, Kim Y. Sequence variations of hepatitis B virus promoter regions in persistentlyinfected patients. Arch Virol. 2001;146:279-292.  [PubMed]  [DOI]
18.  Kajiya Y, Hamasaki K, Nakata K, Nakagawa Y, Miyazoe S, Takeda Y, Ohkubo K, Ichikawa T, Nakao K, Kato Y. Full-length sequence and functional analysis of hepatitis B virus genome in a virus carrier: a case report suggesting the impact of pre-S and core promoter mutations on the progression of the disease. J Viral Hepat. 2002;9:149-156.  [PubMed]  [DOI]
19.  Raney AK, McLachlan A. Characterization of the hepatitis B virus major surface antigen promoter hepatocyte nuclear factor 3 binding site. J Gen Virol. 1997;78:3029-3038.  [PubMed]  [DOI]
20.  Li J, Ou JH. Differential regulation of hepatitis B virus geneexpression by the SP1 transcription factor. J Virol. 2001;75:8400-8406.  [PubMed]  [DOI]
21.  Bogomolski-Yahalom V, Klein A, Greenblat I, Haviv Y, Tur-Kaspa R. The TATA-less promoter of hepatitis B virus S gene contains a TBP binding site and an active initiator. Virus Res. 1997;49:1-7.  [PubMed]  [DOI]