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世界华人消化杂志. 2003-07-15; 11(7): 1002-1004
在线出版日期: 2003-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i7.1002
乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结构及调节研究
李强, 成军, 程明亮, 钟彦伟
李强, 成军, 钟彦伟, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市 100039
程明亮, 贵阳医学院附属医院传染科贵州省贵阳市 550004
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetheray.com.cn
收稿日期: 2003-01-11
修回日期: 2003-01-20
接受日期: 2003-02-16
在线出版日期: 2003-07-15

N/A

关键词: N/A
引文著录: 李强, 成军, 程明亮, 钟彦伟. 乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结构及调节研究. 世界华人消化杂志 2003; 11(7): 1002-1004
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: January 11, 2003
Revised: January 20, 2003
Accepted: February 16, 2003
Published online: July 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)持续感染导致全球性健康问题. 世界人口约6%是病毒携带者, HBV也是导致肝硬化和肝癌的危险因素. HBV要持续感染人体, 必须要有持续的病毒复制, HBV基因表达精确调节对病毒复制起关键作用. HBV基因组分为结构基因序列和调节基因序列两大部分. 调节基因序列和结构基因序列相互重叠, 即使结构基因序列本身也有部分重叠, 因此, HBV具有结构紧密的特点. HBV序列是在C、S1、S2、和X启动子控制下转录的. 除了表面抗原基因启动子Ⅰ(SPⅠ), 所有其他启动子缺乏TATA盒. 两个增强子和负调控元件进一步控制HBV RNA合成, 所有转录调控元件插入蛋白编码的基因区. SPⅠ作为指导2.4 kb mRNA转录的启动子序列, 在HBV复制中具有十分重要的作用.

1 HBV SPⅠ启动子的结构

HBV的S基因有两个串联的启动子SPⅠ和SPⅡ. SPI(2 219-2 780 nt)在HBV基因组5'至前S1区, 含有典型TATA盒(TATA box)的序列[1], 并含有特异性肝细胞核因子1(hepatocyte nuclear factor 1, HNF1)的结合位点. HNF1结合位点与TATA盒之间相隔45 bp, 中间还有一个八聚体结合蛋白1结合位点. HNF3结合位点位于HNF1与TATA结合蛋白之间[2]. 转录因子蛋白Sp1结合位点与TATA盒结合蛋白位点重合[2]. 而且SPⅠ启动子也与其他转录因子相互作用而增加2.4 kb mRNA转录产生. HNF1结合位点主要出现于某些仅在肝细胞中专一表达基因的启动子区. HNF1的结合是SPⅠ启动子在分化的肝癌细胞株中进行高水平转录的必要条件. 另外, SPⅠ的腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)核苷酸丰富区中还有一个AFP-1(一种可与甲胎蛋白基因的增强子及启动子结合的核因子)结合位点, 也可能与肝细胞特异性的转录有关.

2 HBV SPⅠ启动子的调节蛋白

启动子及其基因序列本身并没有活性, 只有结合转录因子蛋白后才有功能.转录因子中核受体超家族成员在HBV转录过程中具有十分重要的作用, Raney et al[3]研究了HNF4、视黄酸X受体(RXR)、过氧化物酶增强子激活受体(PPAR)等在分化型HepG2细胞系中对于HBV结构中的4段启动子活性的调节作用, 发现CP和HBsAg大蛋白启动子(SPⅠ)受到HNF4的反式激活调节作用, 而增强子Ⅰ(ENHⅠ)/X基因, 核心蛋白和HBsAg大蛋白基因启动子则受到RXR和PPAR的反式激活.

Lee et al [4]建立了p53抑制HBV复制的HepG2细胞模型, 这一模型证实了p53下调HBV所有4种启动子序列的表达活性. 他是通过直接与TATA结合蛋白复合物或CCAAT结合因子作用而发挥抑制功能.利用报告基因, 用转染实验分析HBV启动子的活性表明XP和CP的活性比SPⅠ和SPⅡ高[5,6], 其原因还不清楚. ENHⅡ能在一定位置和方向上以独立的方式刺激两个表面蛋白基因启动子和X基因启动子的转录活性. ENHⅠ对表面抗原mRNA转录影响有限[7]. 这可能与他的位置有关.

3 HBV SPⅠ调节

作为调节元件的一段DNA序列, 可与某些细胞蛋白或病毒蛋白结合, 正性或负性调节转录. 分散在整个HBV基因组中的每个调节元件, 包括4种启动子, 2种增强子(Enh), 包装信号, 糖皮质激素应答元件(GRE)等, 与细胞或病毒产生的调节因子结合后, 分别调节(加强或抑制)不同基因表达; 而不同基因可受同一调节元件控制. 这些调节元件在基因组中的相对位置, 提示可以协同方式, 控制HBV基因的表达.细胞RNA聚合酶Ⅱ和转录因子结合于启动子序列, 启动RNA的合成.

反式激活的多种细胞因子(NF1、C/EBP、AP1、HNF1等) 结合在增强子的特定部位, 反式激活Enh增强转录的活性. Enh序列上的这些特定的保守部位与其细胞因子相互作用, 才可能有效激活基因的启动子. 细胞核因子NF1对激活S基因的转录很重要.

EnhⅠ的活性对HBsAg的表达影响小, 而EnhⅡ活性对于HBsAg的表达具有显著的影响[26]. EnhⅡ对分化的肝细胞和肝癌细胞具有显著的特异性, 可增强SP1、SP2、CP和X启动子的转录, 肝细胞核内有多种因子与EnhⅡ的两个元件特异性的结合, 顺式激活前S1的启动子SPⅠ. 在慢性HBV感染中, 病毒与宿主细胞染色体整合时常导致EnhⅡ的缺失, 从而改变了外膜蛋白的相对量, 大蛋白明显减少.

多聚腺苷酸(PolyA)加尾信号及糖皮质激素反应元件均属于HBV的顺式作用元件, PolyA加尾信号是转录终止及加PolyA尾所必须的序列, GRE序列可与激活受体结合, 从而提高特定基因的转录水平, GRE表现出增强子的基本特征.在转基因小鼠中表达HBsAg被6种类固醇和糖皮子激素调节, 经地塞米松处理后, ♂转基因小鼠对HBsAg的表达水平高于♀.

乙肝病毒X抗原(HBxAg)能反式激活许多病毒和细胞基因, 通过结合和修饰包括AP1、AP2、ATF2、CREB、TBP、TF2H、TF2B等转录因子的功能起作用[8,9,17-20], HBxAg刺激所有HBV启动子到一个相似程度(2-3.5倍)[6,10], S1启动子也不例外. Sp1转录因子与SPⅠ的Sp1结合位点结合后, 反式激活SPⅠ, 但其单独发挥作用小, 而是以协同方式发挥作用[11]. TATA盒结合转录因子TFⅡD, TFⅡD结合RNA聚合酶Ⅱ, 即在启动子下游的约30 bp处开始转录. Raney et al[21]研究表明转录因子HNF1和HNF3对SPⅠ的转录调节具有重要作用, 他们作用的位置在肝脏而不在其他组织. 这两种因子协同作用可能抑制2.4 kb mRNA的转录. 在PolyA加尾信号、GRE、ENHⅠ、ENHⅡ和HBX及其他的细胞因子作用下顺式或反式激活SPⅠ, SPⅠ开始发挥调节功能. SPⅠ调节2.4 kb的mRNA转录, 编码大蛋白. 2.4 kb的mRNA开始于2 812 nt, 其上游20 bp是SPⅠ的TATA盒, 准确控制转录的开始. SPⅡ调节2.1 kb mRNA, 编码中、主蛋白, 两种启动子都具有同等的活性, 但是在HBV感染细胞中, 2.4 kb mRNA的表达量明显低于2.1 mRNA[22-24].因而细胞内主蛋白的量明显高于大蛋白. 由于大蛋白的增加易导致病毒包膜蛋白在细胞内蓄积, 引起细胞病变效应. 因HBV各种包膜蛋白的这种比例不仅有利于感染性HBV颗粒成熟于释放, 而且有利于宿主细胞的生存, 使二者能共生共存[16,25]. 因此, 三种外膜蛋白的产量有正常比例, 大蛋白过量时, 将顺式干扰SPⅡ, 从而降低基因的转录水平. Lu et al[12]研究表明SPⅡ含CCAAT序列, 是一种调节蛋白正常比率的重要因素, 正调节S转录, 促使主蛋白产量增加, 负调节前-S1转录, 使大蛋白的产量减少, 而维持大/中蛋白<1/5的正常比率. 参与HBV基因组转录调节的还有多种反应激活蛋白, 包括来自病毒基因组X区和前-S/S区的表达产物, 也包括来自宿主细胞的各种转录调节因子. 在对宿主细胞的反应作用因子中, 既有肝细胞特异性的调节蛋白(如HNF1, C/EBP, 其mRNA主要出现于肝组织, 并具有特定的结构域), 也有在各种细胞存在的细胞因子; 既有序列特异性的DNA结合蛋白, 也有通过蛋白质-蛋白质相互作用而发挥功能的调节因子.

4 S基因启动子变异的影响

Xu et al[14]从1例慢性肝炎患者血清中分离到S基因启动子缺失变异株, 转染肝癌细胞后, 大蛋白过度表达, 而中、主蛋白表达减少, 因而病毒及亚病毒颗粒的分泌都受到抑制, 肝细胞内大蛋白堆积, 认为可能是慢性肝炎肝细胞毛玻璃样变性的原因. 他们进一步研究发现, 过度表达的大蛋白在肝细胞内质网通过激活grp78和grp94启动子, 改变宿主细胞的生理功能[15]. 转基因小鼠模型已经证实, 若大蛋白过度表达, 在肝细胞内堆积, 将导致肝细胞内质网肿胀, 肝细胞变性. 因此, 在感染过程中, 改变大、中、小蛋白的比例将影响疾病的进程.

总之, 有效的HBV复制要求有精确调节转录的HBV序列. C、S1、S2、X启动子调节mRNA的产量. 两个增强子增加启动子的活性. 肝丰富的转录因子如HNF-1、HNF-3和HNF-4认为是病毒嗜肝性的决定因素. 因此, SPⅠ不是单独的起作用, 而是与其他的启动子、增强子和转录因子相互作用, 构成HBV转录的平衡系统. 有目的的控制S1启动子的启动将打破这种平衡, 是阻断HBV复制的有趣治疗模式.

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