修回日期: 2002-10-30
接受日期: 2002-11-06
在线出版日期: 2003-06-15
病毒性肝炎是目前严重危害人类健康的最常见的世界性感染性疾病之一, 迄今仍无有效的抗病毒药物. 抗病毒基因疗法作为一种新的治疗手段, 可望从病因上解决病毒性肝炎的治疗问题. 本文结合我们自己的研究综述抗肝炎病毒基因疗法的研究现状和面临的挑战, 重点介绍抗肝炎病毒核酶和DNA免疫的研究.
引文著录: 贾战生, 冯志华, 周永兴. 病毒性肝炎基因治疗的研究和面临的挑战. 世界华人消化杂志 2003; 11(6): 810-814
Revised: October 30, 2002
Accepted: November 6, 2002
Published online: June 15, 2003
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2003; 11(6): 810-814
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v11/i6/810.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v11.i6.810
病毒性肝炎是目前严重危害人类健康的最常见的世界性感染病. 乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染容易慢性化, 并与肝硬化和肝细胞癌(HCC)的发生密切相关, 严重危胁人类身心健康[1-10]. 由于HBV和HCV基因变异和机体对病毒的免疫耐受, 导致干扰素和抗病毒核苷类药物的治疗效果也不令人满意[11-14]. 因此, 寻求新型抗肝炎病毒药物成为迫切需要.
基因治疗技术的发展, 为抗肝炎病毒治疗研究提供了新的机遇[15-17]. 随着分子生物学技术的发展和人类基因组计划的完成, 基因疗法也从过去的治疗遗传性疾病发展到医学的许多领域, 如慢性病毒感染[18-21]、心血管系统疾病[20,21]、肿瘤[22-26]、自身免疫性疾病[27-29]、代谢性疾病[30,31]等, 并取得了突出的进展. 基因治疗的定义和内容也随之扩大, 即通过转导目的基因达到治疗疾病的目的均属基因治疗范畴. 抗病毒性肝炎基因治疗是基因疗法的一个重要分支, 尤其在严重威胁人类健康的HIV、HBV和HCV的研究方面取得了很大进展. 目前, 用于抗肝炎病毒基因治疗的主要策略包括: 反义技术、核酶(ribozymes)[32,33]、基因免疫[34-38]、干扰肽或蛋白质[39]、优势负突变物(dominant negative mutants)、单链抗体等. 本文结合我们的研究回顾10 a来国内外抗肝炎病毒基因治疗的研究现状和面临的挑战, 重点介绍核酶和基因免疫的研究.
核酶是生物体内一种具有催化功能的小RNA分子, 普遍存在于自然界[40]. 通过对核酶进行人工设计和改造, 人们可以获得自然界罕见的、定向的RNA内切酶, 用于生物学研究[41-45]. 由于核酶具有特异结合靶RNA分子, 可以干扰或阻断靶基因的复制和表达, 并且结构简单, 可人工设计合成, 因此是当前抗肿瘤和抗病毒基因治疗的重要手段之一, 尤其用于慢性持续性病毒感染的基因治疗. 1991年Saver et al首先将核酶用于抗人免疫缺陷病毒(HIV)的研究. 目前抗HIV核酶已进入临床前期研究, Li et al选用人造血干细胞, 来源于胎盘或脐带的CD34+细胞, 他们以10名新生儿中取来CD34+细胞, 用SCF因子, IL-3、IL-6刺激细胞生长, 用MJT载体表达发夹状核酶, 结果表明对正常细胞, HIV暴露组, HIV感染组之间生长无明显差异, 细胞培养可达4 wk以上, 用不同的方法都观察到核酶转染细胞可明显抑制HIV的复制. 他们认为通过转染抗HIV核酶CD34+干细胞, 可有效阻止HIV的感染. 美国和澳大利亚已将抗人免疫缺陷病毒核酶用于Ⅰ期和Ⅱ期临床验证, 取得了令人满意的效果. 1992年, von-Weizasacher et al率先开展了抗HBV核酶的研究工作. 他们选择设计了3个锤头结构核酶, 在体外转录HBV和核酶RNA分子, 在特定条件下温育, 通过丙烯酰胺凝胶电泳和放射性自显影技术显示核酶对靶基因的切割作用, 并计算其切割率. 作者还证明了多位点核酶联合可提高切割效率, 并可用来对抗病毒的变异. 随后, 世界各地的许多学者先后对HBV和HCV核酶进行了广泛而深入的研究. 2000年Zhuang et al [44]报道, 用双位点核酶的真核表达载体, 在细胞中表达针对HBV的X基因的核酶, 结果表明不但使HBV X蛋白大为下降, 而且使S抗原亦有下降. Macejak et al [46]设计了15个锤头状核酶, 针对HCV的5'TR区域, 在以荧光素酶为报道基因的细胞研究系统中, 这15个核酶都有抑制活性, 从40-80%不等, 个别的可达90%以上, 提示这是一个潜在的治疗HCV感染的方法.
体外研究结果表明, 理想的靶序列和切割位点选择是核酶研究的关键, 计算机设计和核酶文库是当前选择设计抗病毒核酶的有效方法, 锤头结构和发夹结构核酶由于分子较小, 容易通过多种途径获得, 故成为目前最多选用的两种核酶类型. 我们应用上海生物化学研究所陈农安编制的核酶设计软件, 成功地设计了抗HBV C区基因mRNA的三位点核酶, 并设计了针对HCV 5非编码区(213和260位点)和C区(407和498位点)的锤头结构核酶[46]. Lieber et al报道, 从核酶文库中筛选的出6个针对HCV RNA保守序列的锤头结构核酶, 用重组腺病毒载体, 在稳定表达HCV基因产物CHO细胞和感染HCV的患者分离的肝细胞证明, 单个核酶或联合核酶均能降低HCV RNA水平. Putlitz et al学者用重组筛选方法从一个发夹型核酶库中(5×105)确定能有效地在转基因人肝癌细胞(HHC)中切割HBV前基因组RNA的4个发夹型核酶. 通过实验发现HBV RNA上有40个部位可以和核酶结合, 从中选出17个在HBV所有亚型中都存在的序列, 设计了4个发夹形核酶, 与靶基因共转染于HHC细胞系. 结果表明: 核酶对HBV的抑制率分别为80%, 69%, 66%和49%.
我们于1996年开始了抗HBV核酶的研究工作[47]. 首先利用计算机辅助设计了三个针对HBV C基因mRNA的锤头结构核酶, 在其5-和3-端带有自剪切核酶. 结果表明: 该核酶在细胞外能特异切割靶RNA分子, 串联或联合核酶切割效率明显高于单个核酶; 在转染HBV基因的人肝癌细胞系(2.2.15), 通过脂质体介导的基因转染方法证明, 该核酶可有效抑制HBeAg的表达, 其抑制率为55-66%. 我们又选择了HCV5非编码区和C区, 设计了4个锤头结构核酶, 应用基因重组方法构建了带自剪切的核酶真核表达载体(pcDNA3), 与靶基因(pCMVNCRluc)共转染于人肝癌细胞(HHCC), 以luc为报告基因证明, 抗HCV 5非编码区核酶可有效抑制病毒的复制, 其抑制率在40-70%之间[48,49]. 最近, 我们又将抗HCV 5非编码区核酶与抗C区核酶联合转染, 结果表明联合核酶的抑制活性较单个核酶显著增高. 国内许多学者近年也探讨了不同结构核酶对HBV和HCV的抗病毒研究. 同济医科大学最近报道设计了带有自剪切的发夹结构核酶, 在体外证明可特异切割HBV核心基因[50]. 第一军医大学也报道设计并构建了HBV特异性核酶, 并在体外证明其切割活性[51]. 上海生化所最近报道他们设计的抗HBV锤头结构核酶与靶基因共转染HepG2细胞, 发现可有效地抑制HBV基因的表达, 其抑制效率与释放的核酶量有关[52,53]. 由于缺乏肝炎病毒感染的小动物模型, 黑猩猩代价昂贵, 国内抗肝炎病毒核酶的研究患处在细胞水平, 尚未见到动物实验研究报告.
核酶同其他基因治疗技术都受到两个基本技术的限制, 即将目的基因有效地导入靶细胞, 目的基因的表达达到治疗水平[54].抗肝炎病毒核酶导入体内的方法有2种策略[28]: (1)从宿主分离肝细胞, 在体外将核酶基因导入肝细胞, 再将带有核酶的基因移植到宿主肝脏, 这也是当前基因治疗研究的一种有效方法, 随着人骨髓造血干细胞在体外的培养成功可大大促进干细胞基因治疗的发展; (2)直接将核酶真核表达载体通过某种途径到入体内, 该技术简单, 但受到体内分布, 靶细胞内定位等条件的影响. 最近Lee et al [55]观察了抗HCV 5非编码区195位点的一个核酸抗性核酶在C57Bl/6小鼠体内的分布和药代动力学. 32P标记的核酶通过皮下或静脉给药, 计量为10 mg/kg或30 mg/kg, 其肝脏的高峰浓度比体外细胞抑制浓度的值高. 该核酶在皮下的吸收达89%, 其半衰期为23 min. 为了确定核酶在靶组织的细胞内定位, 作者应用四甲基罗丹明标记核酶注射小鼠, 15 min-48 h可在肝组织发现核酶荧光, 静脉途径可达72 h, 当15-30 min时在肝细胞胞核和胞质内均发现绿色荧光. 结果说明该核酶主要由肝细胞摄取, 具有靶细胞"倾向性".
提高核酶对靶基因的抑制效率一直是研究者们追求的目标. 最近Macejak et al [56]报道, 在体外IFN-α可增强核酶的抗病毒抑制作用. 作者以HCV-脊髓灰质炎病毒嵌合体为靶, 设计了针对HCV5'非编码区核酶, 在HeLa细胞证明抗HCV核酶、IFN-α均可有效地抑制病毒的复制, 当联合核酶时IFN-α的浓度可减少5-12.5倍, 当加入适量的IFN-α, 核酶的浓度也可减少3倍. 结果表明低剂量的IFN-α增强核酶的抗病毒作用, 其抑制率达98%, 说明IFN-α联合抗病毒核酶可能提高治疗效果. 虽然近年来, 有许多核酶药业公司也开始了核酶抗肝炎病毒的研究, 美国Welch et al和Wu et al[57]的实验室进行了核酶对HBV和HCV基因治疗的研究, 并拟用于Ⅰ期和Ⅱ期临床试验. 然而, 已报道的研究结果缺乏动物体内的研究, 尚未见人体的研究报道. 核酶在细胞水平对病毒基因表达的抑制作用还不理想, 对机体的毒理作用研究还不够, 需要进一步加强核酶抗肝炎病毒基因治疗的基础和临床研究.
基因免疫又称DNA免疫, 由于这种外源基因具有疫苗功能, 又称为DNA疫苗, 他是疫苗研究史上的一次革命, 故称之为第三代疫苗[58]. 由于基因免疫具有预防和治疗病原感染的作用, 又是通过转基因手段实现, 因此, 被认为是一种新的基因治疗策略. 基因免疫与其他基因治疗策略不同, 他通过诱导机体免疫应答实现治疗目的, 并产生持久的免疫力, 而且制备过程简单, 实施治疗容易, 受到广泛重视. 1996-02在美国联合召开了基因疫苗质量控制与标准化研讨会, 会议制定了基因疫苗临床实验指南. 目前美国食品与药品管理局(FDA)已批准几项有关HIV、HBV、人乳头瘤病毒(PHV)、疟原虫、流感病毒、结核杆菌等DNA疫苗进行临床研究, 其中疟疾DNA疫苗在Ⅰ期或Ⅱ期临床研究中均取得满意的保护效果, 已进入Ⅲ期临床, 极有希望获得批准. 1993年, Davis et al首先开始了抗HBV DNA疫苗的研究. 迄今, 国内外学者先后研究了HBV和HCV不同基因片段免疫应答效果, 并证明在小鼠体内, 可诱导特异性抗体产生和特异性细胞毒T(CTL)细胞反应. 我们也研究了HBV S片段的免疫应答作用, 并观察了IL-12及免疫共刺激序列(CpG)对DNA免疫的增强作用[59-61]. 最近Oka et al[58]研究报道, 将HBVS大蛋白及中蛋白真核表达载体注射转基因小鼠, 结果28/30只小鼠HBsAg清除, 而对照组6/29只有效. 其他研究亦证明, CpG、IL-2和IL-12[62]均能增强HBV DNA免疫效诱导细胞和体液免疫应答. 应用HBV转基因小鼠, 注射pCMVS2S可完全清除血浆中的HBsAg, 并能长时间抑制肝细胞表达HBsAg[62]. 他们又将pCMVS2S注射黑猩猩, 也证明可保护其免受HBV感染量的攻击, 结果提示应用HBV基因免疫可以预防和治疗HBV感染, 为HBV DNA疫苗临床研究奠定重要的实验基础[62].
HCV病毒编码被膜蛋白(E)的基因容易发生变异, 机体缺乏保护性抗体产生, 传统疫苗的研究又遇到一定困难. 因此, 抗HCV基因免疫的研究更具有迫切性和实际意义. Arichi et al[63]比较了6种HCV不同基因区DNA疫苗诱导免疫应答的作用, 结果表明6种重组质粒均能在小鼠体内刺激特异性抗体应答, 而CTL应答仅在含C基因的质粒组中产生. 我们选择了HCV C或与结合E1E2区, 构建了真核表达载体, 并联合IL-2或IL-12质粒载体共同免疫小鼠[64], 结果表明HCV结构区基因与pIL-2联合免疫, HCV特异性抗体水平升高, 而对CTL的杀伤作用增强不明显, 与IL-12质粒共免疫, 诱导的抗体反应和CTL活性均明显增强, 尤以细胞免疫为著, 提示pIL-12可增加HCV特异性细胞免疫反应. 我们又应用转染HCV C蛋白的SP2/0细胞接种小鼠形成HCV移植瘤为感染动物模型, 观察该质粒免疫对肿瘤形成的影响, 发现应用HCV C基因免疫可显著抑制发瘤时间、延长存活时间, 联合pIL-12质粒, 可显著增加HCV DNA免疫诱导特异CTL反应其活性. 对DNA疫苗诱导免疫应答的机制, 以及提高免疫应答效果许多学者进行了多方面的研究[65-69]. 大多数学者认为骨骼肌是最有效的摄取外源基因表达蛋白抗原的组织. 肌肉组织具有安全、体积大、免疫接种容量大的优点, 因此多被用来进行DNA免疫注射. 肌纤维对外源质粒摄取的具体机制目前还不清楚. 可能因骨骼肌具有丰富的T小管系统和肌浆网结构使骨骼肌肌纤维直接摄取外源DNA. 有作者用编码虫荧光素酶的质粒DNA免疫小鼠后发现, 表达的酶活性呈DNA剂量依赖关系, 而且报道基因可持续表达19 mo之久. 提示DNA肌内注射免疫可产生持久的免疫应答. 此外, 肌细胞合成分泌的外源抗原与产生的特异性抗体可以形成抗原-抗体复合物, 并沉积于树突状细胞表面, 可长效释放Ag, 诱导产生记忆性T、B细胞[70,71].
使编码抗原的基因最佳表达, 并诱导机体产生有效地的免疫应答是实现基因免疫抗病毒治疗的成功的关键. 因此, 国内外学者从多方面探讨增强基因免疫的应答效果, 目前的研究策略集中在优化载体、使用肌肉再生剂、与细胞因子共表达、使用免疫刺激序列(CpG)[68]、应用修饰的树突状细胞(DC)、注射共刺激信号分子及免疫佐剂等. 不同作者均取得了积极的研究结果, 为设计新型临床应用DNA疫苗提供了理论依据. 目前, 印度学者已经用HBV DNA疫苗注射成人, 研究疫苗的安全性及免疫原性[69]. 为了使DNA疫苗制品的申报有章可循, FDA在网上公布了《预防感染病的质粒DNA疫苗制备要点》(points to consider on plasmid DNA vaccines for preventive infectious disease indications). 该要点还对DNA疫苗的修饰、佐剂、和免疫器械的使用等做了规定. 其主要内容包括: DNA疫苗制备要点简介, FDA生物制品评价及研究中心对DNA疫苗制品的基本要求和管理办法, 申报新药应提供材料的基本要求和管理办法, 有效性和安全性评价等. 此外, 对DNA疫苗研制中的靶基因和载体选择、载体的构建和体外转染、动物模型、免疫途径和方法、攻击及保护力的鉴定等相关指标做了规定. 在我国官方尚未提出具体规定之前, 该要点可为国内DNA疫苗研究提供借鉴. 若欲了解详细内容, 可访问下列网站: http://www.fda.gov/cber, http: //http://www.dnavaccine.com, http://www.genweb.com .
病毒性肝炎基因治疗的研究伴随分子生物技术的发展已走过10 a的历程, 在基础和临床前研究均已取得了很大进展, 显示出某些令人兴奋的前景. 但多数研究步入临床过程艰难, 在一些发达国家的研究热潮开始趋于缓慢. 2000年, 美国《Science》周刊发表法国学者Cavazzana et al[72]的文章, 应用转基因方法成功治疗2例患严重联合免疫缺陷综合征(severe combined immunodeficiency, SCID)的患儿, 使基因疗法重又唤起生机. 美国基因治疗研究专家 Anderson et al[73]说: 当前基因疗法正处于最坏的时刻, 也是最好的时刻. 结合我们的研究和目前这一领域的进展, 还需要在以下几方面进一步加强研究. (1)实现目的基因的高效表达和有控表达: 目的基因在细胞内有效抑制是实现抗病毒基因治疗的关键, 应从载体和启动子的优化、转送基因方法的改进、与靶基因的共域化(colocation)和有效调控表达、造血干细胞作为基因载体的潜能[54]等方面进行深入研究. (2)抗原表位的优化组合: 选择HBV和HCV基因的有效抗原表位, 组成T细胞、B细胞表位抗原和辅助性T细胞表位复合抗原, 产生新的复合表位多肽疫苗, 或构建复合表位基因载体, 制备DNA疫苗, 以提高免疫效果[74]. 最近, 有作者提出建立表达库免疫的思路, 可实现选择最有效免疫原部位的优化组合[75,76]. 并可用 Th1和Th2细胞因子基因共免疫以改变基因疫苗诱导的免疫反应类型. (3)加强其他基因治疗方法学探讨 如细胞内干扰肽或蛋白质, 优势负突变物、单链抗体细胞内免疫、IRES特异性抑制性RNA等. 探讨RNA修复技术在肝炎病毒基因治疗中的应用[77], 研究树突状细胞体外基因修饰对DNA免疫的增强作用[70-80]. (4) 加强动物实验研究 缺乏人嗜肝病毒感染的小动物模型限制了抗肝炎病毒药物的发展. HBV和HCV转基因小鼠基因治疗性研究可为临床研究提供依据, 在条件许可下可应用当前唯一对HBV和HCV易感动物-黑猩猩作为研究对象进行研究[81]. 同时应与抗原蛋白联合应用、建立嵌合型或多重抗原DNA疫苗, 以提高基因免疫的保护范围和免疫效果等. (5)进行人体试验研究 在缺乏感染动物模型条件下, 选择志愿者进行临床研究很有必要, 但必须保证其安全性并获得法律上的许可[82].
基因疗法也同其他医学领域的新技术和方法一样, 如抗生素的产生、单克隆抗体技术、器官移植等, 需要多年时间发展, 不断走向成熟, 从早期的期望, 经过一定的挫折和失败, 最后走向成功[73]. 要使基因疗法真正用于人类疾病的防治, 仍有一段很长的路要走, 但我们深信, 随着上述研究的不断深入, 必将给人类疾病, 尤其是难治性的慢性疾病如肿瘤、HIV、HBV和HCV感染等, 带来新的治疗契机[83,84].
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