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世界华人消化杂志. 2003-06-15; 11(6): 791-795
在线出版日期: 2003-06-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i6.791
乙型肝炎病毒慢性感染和肝癌发生
苏勤
苏勤, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院病理科 陕西省西安市 710038
基金项目: 国家自然科学基金项目, No. 3880376, 39470778, 30171052.
通讯作者: 苏勤, 710038 陕西省西安市, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院病理科. qinsu@fmmu.edu.cn
电话: 029-3377467 传真: 029-3552079
收稿日期: 2002-10-10
修回日期: 2002-12-15
接受日期: 2003-01-10
在线出版日期: 2003-06-15

N/A

关键词: N/A
引文著录: 苏勤. 乙型肝炎病毒慢性感染和肝癌发生. 世界华人消化杂志 2003; 11(6): 791-795
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: October 10, 2002
Revised: December 15, 2002
Accepted: January 10, 2003
Published online: June 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是人类最常见的恶性肿瘤之一. 在世界范围内居男性最常见恶性肿瘤的第7位, 居女性第9位; 在中国被列为男性恶性肿瘤的第3位, 仅次于胃癌和食管癌. 全世界每年大约43.7万人被诊断为HCC, 其中约一半发生在中国. 多数HCC在发现时已进入进展期, 恶性程度高, 其5 a存活率小于3%[1]. 近年来的流行病学和实验室研究初步表明, HCC的主要发病因素有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)慢性感染、黄曲霉素B1(aflatoxin B1, AFB1)的摄入以及酗酒. 在我国, HBV慢性感染是一种最常见的致病因素, 在启东和广西的某些地区还有AFB1摄入这一因素同时存在.

1 HBV与HCC的关联: 流行病学证据

HCC在不同国家或地区发生率差别很大, 男性HCC年发生率在莫桑比克高达112.9/10万, 而在欧洲多数国家仅为3/10万, 这种地理位置上的差异与世界范围内的HBV感染率基本一致. 来自大多数地区的数据证实HCC发病率与乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)携带率呈正相关. 另一方面, HCC患者中HBsAg携带率与所处的地区密切相关, HCC高危地区, 塞内加尔为61.2％, 南非为61.6％, 香港为82.0％, 中国大陆为86.0％, 菲律宾为70.0％; 中危地区希腊为45.9％; 低危地区美国为14.7-17.9％[2,3].

在中国, 至少80％的HCC发生于HBsAg携带者, 而HBsAg携带者中HCC发生率显著高于不带HBsAg的人群. 在一项对22707位中国台湾居民的长达6 a的前瞻性调查中, Beasley et al发现HBsAg阳性人群中HCC年发生率为528/10万, 而HBsAg阴性个体仅为2.5/10万, 相对危险性为217, 并发现携带HBsAg与其他癌症和肝内转移癌之间没有联系, 证明了HCC与HBV持续感染之间关联的特异性[4].

HBV感染发生在HCC发生之前, 围产期感染并转为慢性过程是HCC发生的危险因素之一[5]. 在诸如南部非洲、中国台湾和新加坡等HBV感染发生率较高的地区, HCC常发生于较年轻的个体(50岁以下), 甚至在儿童; 而在欧洲和美洲, HCC多发生于50岁以上的个体.

对于这些看起来十分可靠的数据应该指出两点. 第一, 上述所谓HBV慢性携带者仅指HBsAg携带者, 尚不包括HBV隐匿型感染[6]. 最近的一项研究显示, 在某些所谓"HCV相关"的HCC组织[7]和血清标本[8,9]中也存在HBV序列, 提示至少在部分"HCV相关"的HCC病例中, HBV隐匿型感染也是一种可能的致癌因素[6,9]. 第二, 上述流行病学研究数据只是表明HBV慢性感染与人HCC有关, 要证实HBV参与人HCC发生还需许多直接证据, 主要包括实验研究和针对HBV的干预疗法对HCC发生的影响的研究.

2 HBV和HCC的关联: 实验室证据

几个方面的实验室研究已经确立了HBV和HCC之间有着明显且特异的联系, 但这种联系仅限于HBV持续性感染.

2.1 动物模型的研究

HBV是一种嗜肝DNA病毒, 呈环状的DNA部分为双股, 基因组长度仅为3200 bp左右, 但却有6个部分重叠的开放阅读框架. 三种动物嗜肝病毒与HBV在形态和基因组结构上极为相似, 即土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus, WHV), 地松鼠肝炎病毒(ground squirrel hepatitis virus, GSHV)和中国家鸭乙型肝炎病毒(duck hepatitis B virus, DHBV), 他们都是部分双股DNA病毒, 有与HBV相似的S抗原、C抗原和DNA聚合酶(P)等编码区. HBV、WHV和GSHV还有第四个基因编码框, X基因, 编码x蛋白. HBV与WHV、GSHV和DHBV之间同源核苷酸比例分别为70%、50%和40%, 都能引起肝脏慢性持续感染, 形态学上类似于慢性肝炎. 近20 a来人们对于WHV与HCC的研究为HBV的致癌作用提供了一系列间接的, 但却强有力证据. 从幼龄时感染WHV的土拨鼠几乎100%在3 a之内发生HCC, 而未感染的土拨鼠HCC自然发生率极低; 虽然DHBV持续感染也能引起病毒DNA整合入肝细胞并能造成基因重排, 但其致癌能力至今还未确立[10].

2.2 HBV DNA转基因动物研究

HBV感染具有明显的种属特异性, 如何建立与人自然感染情况相似, 但又经济方便的HBV感染动物模型一直困扰着科学家们. 向小鼠受精卵或早期胚胎中注射HBV DNA或其片段, 由此在子代小鼠中部分成为HBV转基因小鼠. 目前已成功地进行了HBV S基因及X基因的转基因研究, 结果是有启示意义的.

Kim et al [11]在1991年首先报道, 涉及到HBV x蛋白(HBV x protein, HBx)编码区的转基因可诱发小鼠癌前变异肝细胞病灶(foci of altered hepatocytes, FAH)和HCC, 表明了HBx在肝脏的致癌性. 在其后的研究中, Koike et al[12,13]表明, HBx致癌性的强弱与其表达水平有关.

另一个HBV转基因动物模型是Chisari et al[14]制备的. 他们把含PreS1/S2的HBV DNA片段与小鼠白蛋白启动子一起构建成重组体, 这种转基因小鼠肝细胞中大量表达HBsAg(p25, gp27)及PreS1/S2多肽(p43, gp45), 导致大部分肝细胞中这些蛋白异常储积于滑面内质网内, 形成毛玻璃样细胞. 在这些小鼠肝脏中, 出生后6 mo开始出现FAH, 9 mo出现肝细胞腺瘤, 存活12-34 mo的31只动物中, 有8只出现HCC (25.8%)[15]. 然而, 这一模型中有2个事实值得注意. 首先在肝实质的肿瘤前期病灶FAH及肿瘤细胞中, HBsAg表达明显减弱或已停止, 这种HBsAg表达与HCC发生和进展的关系在HBV持续感染的人肝脏中也存在[16]; 其次, Chisari模型中所用的重组体合有HBx编码序列, 尚不知道这一模型中有无HBx表达, 因而不能完全除外HBx的致癌作用.

2.3 HBV DNA的体外细胞转染实验

Schaefer et al[17]用HBV DNA转染经SV40大T抗原(SV40-TAg)基因永生化的小鼠肝细胞系FMH202和转化生长因子α(transforming growth factor α, TGFα)永生化的小鼠肝细胞系AML12, 得到了稳定表达HBV颗粒的克隆, 这些克隆都获得转化能力. 此外, 用HBV DNA转染永生化细胞系NIH3T3和HepG2细胞系也使其转化. 应用HBV DNA中部分片段进行细胞转染观察显示, x蛋白编码基因最有可能是一种肿瘤基因, 在高水平表达的情况下能在短期内引起细胞转化.然而, 这些体外实验结果能够在多大程度上反映体内情况？在自然感染的人或动物肝脏中, x蛋白表达水平远低于上述转染细胞或转基因动物肝组织. 实际上, 直到最近才在WHV感染的土拨鼠肝脏内经免疫沉淀浓缩和高度敏感的化学发光检测技术证明x蛋白的存在[18]. 在HBV感染的人肝组织中HBx含量可能更低, 其检测始终是一个相当困难而又充满争议的问题.

2.4 HBx的功能及其与人HCC发生的关系

2.4.1 HBx的功能 HBx是一种154 aa 小肽, 其功能仍未完全搞清. 在WHV, x蛋白为病毒复制所必需, 但对HBV的复制没有如此重要. 已报道HBx有许多功能, 其中与宿主细胞的生长调节有关的功能可能与HCC发生有关. (1) 反式激活其他基因: 主要是应用几个细胞系(包括HepG2、HuH7和NIH3T3)发现的. 其靶基因既有病毒序列, 也有细胞序列. 前者包括HBV基因组中C基因P/EnhI/II、 S1基因P/EnhI/II、S2基因P/EnhI/II和X基因P/EnhI、HIV-1的LTR、HSV的TK、MMTV的LTR、RSV的LTR、SV40的P/Ehn和CMV的P/Ehn; 后者包括M-肌动蛋白、白蛋白和α-球蛋白等编码基因, HLA-DR/MHC、全属硫蛋白及β-干扰素、丙氨酸tRNA(tRNAAla), 原癌基因c-myc、c-jun、c-fos、ras、raf, 以及AP-2、NF-kB、增强子结合蛋白(EBP)、TATA结合蛋白(TATA-BP)、TGFb、CDK2和CDC2等细胞调节因子的编码基因[19]. 基于上述体外实验结果, 目前认为HBx可能通过反式激活某种类型细胞中的生长调节基因而参与人HCC发生. 已发现人肝脏中胰岛素样生长因子II(insulin-like growth factor II, IGF II)基因在某些散在的(肝小多角细胞)或灶性分布的(小细胞性不典型增生)小肝细胞内先后活化, 而IGF II表达与HBx表达有关, 提示HBx可能通过活化某些肝细胞中的IGF II基因, 引起这种细胞的增生形成肝实质的小细胞性不典型增生, 参与HCC发生[20]. 最近的观察已表明肝小多角细胞不仅参与肝脏实质修复, 而且见于较晚期的混合细胞性FAH中[21], 可能与这些癌前病灶中小细胞性不典型增生有关. (2)结合p53蛋白的能力: p53蛋白由p53肿瘤抑制基因编码, 具有调节细胞周期和细胞凋亡, 以及DNA修复等功能, 与肿瘤细胞的恶性生长紧密关联. P53基因突变可导致p53蛋白失去上述功能, 导致细胞恶变. Feitelson et al[22]报道HBx可与野生型p53结合, 导致后者灭活, 这被认为是HCC的另一发病机制. (3)干扰细胞DNA修复: 近年来的研究显示, HBx可与细胞内的一种DNA修复相关蛋白结合, 这种结合导致宿主细胞对紫外线损伤的抵抗力降低, 这提示HBx也可通过干扰细胞DNA修复过程而参与HCC发生. 此外, 还有报道称HBx和p53的结合也可阻断这种DNA相关蛋白的功能. 但实际上, 这种蛋白间的结合在HBV感染的人肝组织中并不常见[23-25].

2.4.2 HBV感染的人肝组织及HCC中HBx的表达 尽管已在WHV感染的土拨鼠肝组织中成功地检测到x蛋白, 但在人肝组织中检测HBx却非常困难[23,24]. 这可能由于其表达量远低于WHV x蛋白或其半衰期短.

应用重组的HBx或人工合成的HBx片段, 已经制备了至少22个多克隆或单克隆抗体, 其中多数被认为是特异的, 适用于HBx的免疫组化、免疫沉淀、免疫印迹或酶联免疫测定. 然而, 不同实验室应用各自生产的抗体进行的免疫组化和免疫沉淀结果非常不一致, 难以评价. 为了澄清这一问题, Su et al[24]从5个实验室收集了上述抗体中的11个, 对其进行了鉴定. 结果表明, 几乎所有抗体都识别黏附于纤维素膜上的HBx, 但与组织内的HBx结合的特异性或亲和力多数不完全合格. 应用多种抗体进行免疫组化和免疫沉淀反应, 他们在HBV相关的肝硬变及HCC组织中显示出了HBx, 表明其只存在于HBV慢性感染的肝脏中, 仅见于胞质中. 阳性细胞包括FAH内或外的肝细胞、肝小多角细胞以及HCC细胞. 阳性细胞数在肝硬变组织中少, 在有的FAH和HCC组织中较多, 这不同于HBsAg和HBcAg的表达. 后二者虽然在慢性乙型肝炎及肝硬变组织中常广泛表达, 但在FAH及其形成的结节中表达明显减弱, HCC组织中表达基本停止. 由于癌周肝硬变实质大部分被变异肝细胞病灶或结节占据, 其HBsAg和HBcAg表达水平远低于不荷HCC的肝硬变. 这些数据表明, 在HCC发生(肝实质细胞→变异肝细胞病灶FAH→变异肝细胞结节→HCC)的过程中, HBx表达得到选择性地保持, 提示他参与人HCC发生. 他们的结果还表明, 无论是在HCC中, 还是在肝实质中, HBx和p53表达的组织学及亚细胞分布都不同, 在其匀浆中也未发现他们的免疫共沉淀证据. 这表明二者在人肝组织及HCC中独立存在[25].

2.4.3 HBx与人HCC发生 有充足的体外及动物实验证据表明HBx是一种致癌基因, 但要在人体肝脏证实这一点还需大量证据. Feitelson et al[19,22]提出HBx通过结合p53而灭活其功能是HBV诱发HCC发生的一个重要机制, 但HBV感染肝脏中HBx和p53独立存在这一事实不支持上述假说[25]. 基于HBx表达在HCC组织及某些癌前病灶中的选择性保留, HBx对多种细胞生长调节因子的反式激活作用, 以及HBV感染人肝脏中IGF II和HBx表达的密切关系, 有理由认为HBx可通过反式激活某些生长调节基因而参与人HCC发生[10,20,24].

3 HBV和HCC的关联: 临床干预研究

尽管已报道多种制剂可抑制慢性乙型肝炎患者体内HBV的复制, 其中包括针对病毒DNA的反义核酸, 但目前尚无法安全清除肝细胞内的整合型病毒序列. 只有提高人群的卫生及健康水平, 实行大规模的疫苗接种才能从根本上控制HBV的传播. 目前已有70多个国家进行儿童普遍预防接种. 在出生后3 mo内进行预防接种已经使HBV传播发生率及病毒携带者的出现率显著降低. 如果上述免疫保护作用能够导致相应人群中HCC发生率显著降低, 将是HBV感染与人HCC发生之间因果关系的直接证据.

HCC多发于40-60岁的成年人, 因此要全面观察HBV免疫接种后HCC发生率的降低至少需40 a. 已有证据表明, 这种接种免疫已经导致接种人群中HCC发生率显著减低. 在中国台湾, HCC是一种较常见的儿童恶性肿瘤, 100%发生于HBV携带者. 1997年的一项统计报告显示, 在6-14岁年龄组, HCC年发生率已由1981-1986年的0.7/10万降至1986-1990年的0.57/10万, 1990-1994年又降至0.36/10万; HCC年发生率在1974-1984年间出生的儿童中为0.52/10万, 在1984-1986年间出生的儿童中降到0.13/10万[26]. 来自韩国的最新统计资料表明, 即使在成人, 通过注射HBV疫苗进行人工免疫也能显著降低HCC发生的危险性[27].

上述数据表明, 人HCC发生确与HBV持续感染有关. 同时也显示, 通过全球性地HBV疫苗接种, 人类会在很大程度上预防HBV相关HCC的发生.

4 HBV感染诱发HCC的可能模式以及肝实质内的"癌前病变"

HBV相关的HCC发生机制仍未完全搞清. 较有影响的模式有以下三个: (1)HBV DNA嵌入激活某些原癌基因; (2)HBx的反式激活其他肿瘤相关基因; (3)HCC发生的多阶段模式(多步多击理论)和抵抗细胞(R细胞)理论[10].

肿瘤的发生是一个逐渐演进的过程, 人体某些部位发生的增生性病变容易演变为癌, 称为癌前病变. 已提出的人肝脏内"癌前病变"主要包括以下五种.

4.1 肝实质的大细胞性改变(large-cell change, LCC)

又称肝细胞异型增生(liver cell dysplasia). 1973年由Anthony et al[28]描述, 是指肝细胞体积增大, 伴核增大、核多形及多个核出现, 多年来一直被某些作者认为是"癌前病变". 然而, 近年来的研究表明肝实质细胞的这种改变不是癌前病变, 而是对某些致病因子的反应, 可能反映了肝细胞的有丝分裂障碍[21,29].

4.2 肝实质的小细胞性改变(small-cell change, SCC)

又称小细胞性异型增生(small-cell dysplasia), 是1983年Watanabe et al [30]在HBV相关的肝硬变中观察到的一种改变. 作者认为, 某些类型的SCC, 尤其是小细胞性病灶或结节, 可能是一种真性不典型增生, 是肝脏的癌前病变.

4.3 腺瘤样增生(adenomatoid hyperplasia, AH)

这种结节性病变首先被日本学者Arakawa et al描述, 是指硬变肝脏中体积明显大于其周围结节的结节状病变. 多数AH直径0.8-2.0 cm, 常有几个汇管区, 可通过高清晰度的超声波检查发现并被手术切除. 依其是否伴有SCC把这种病变分为普通型AH和不典型AH. 已经知道前者不过是体积较大的再生结节, 与HCC的关系不如后者密切. 但对后者的的性质仍所知甚少, 这一点可以由其拥有许多摸棱两可的描述性名称反映出来[10]. 因此, 国际工作组建议使用"伴肝细胞异型增生的结节"(dysplastic nodule)代表后者, 以取代其他描述性名称[31]. 近年来的研究表明, 部分不典型AH属肝细胞单克隆性增生[32,33].

4.4 变异肝细胞病灶(FAH)和结节(nodules of altered hepatocytes)

FAH是指由细胞学和细胞化学表型明显变异的成熟肝细胞组成的局部病灶. 这种病灶最先在给予亚硝胺类致癌剂的大鼠肝脏内被发现, 后来相继在包括大鼠、小鼠、土拨鼠、火鸡、鱼类以及转基因小鼠几种动物模型中被显示, 在化学致癌物、放射线及致癌病毒诱发的肝癌发生早期出现. 大量的证据表明, FAH是肝细胞肿瘤的前体, 可演变为肝细胞腺瘤和HCC[34]. 实际上, FAH在10 a前已被用作评价药品致癌性的一个指标[35]. 最近的研究表明, 在Bannasch模型上得到的大部分知识都能用于解释人HCC的发生, FAH也见于人肝硬变及其他慢性肝脏病变中, 属于HCC前期病变; 伴有SCC的FAH应被看作肝实质的癌前(恶性前期)病变[21].

4.5 肝硬变

由于约80%的HCC发生于硬变肝脏内, 100 a来肝硬变都被认为是HCC的前期病变. 然而, 不同类型的肝硬变之间发生HCC的可能性有很大差别, FAH发生率及其平均直径也不相同; 另一方面, 并不是所有的HCC都发生在肝硬变出现之后. 因此, 认为肝硬变本身是一种癌前病变的观点在概念和医疗实践上都是不全面的, 肝硬变与HCC之间不是因果关系. 在病理发生过程中二者可能有某种联系, 但他们是两个不同的, 可分开的病理过程. 这正象Theise评论的那样, 如果说二者有联系, 那也更象堂兄弟, 而不是父子关系[36].

致谢

此文的完成曾得益于与刘彦仿、Peter Bannasch、Claus H Schroeder、聂青和教授的讨论, 作者深表感谢.

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