激活素A对肝星状细胞细胞外基质合成的影响

摘要

目的

探讨激活A(activin A, ACT A)对肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成的影响.

方法

采用原位酶灌注法和密度梯度离心法分离HSC. 初次传代后, HSC随机分为8组: 空白对照组(A组)、ACTA 1 μg/L组(B组)、ACTA 10 μg/L组(C组)、ACTA 100 μg/L组(D组)、TGF β₁ 10 μg/L组(E组)、ACTA 1 μg/L+TGF β₁ 10 μg/L组(F组)、ACTA 10 μg/L+TGF β₁ 10 μg/L组(G组)、ACTA 100 μg/L+TGF β₁ 10 μg/L组(H组). 加药后24 h, 采用放射免疫法检测培养液Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原含量及半定量RT-PCR方法测定细胞Ⅲ型胶原mRNA表达.

结果

CT A能刺激体外培养HSC分泌ECM, 在一定浓度范围内(1-100 μg/L)呈剂量依赖关系; 100 μg/L ACT A刺激HSC分泌ECM的能力与10 μg/L TGF- β₁相当, 而且ACT A能协同TGF- β₁发挥这一生物学效应.

结论

激活素A参与肝纤维化形成.

关键词: N/A

Effect of Activin on extracelluar matrix secretion in isolated rat hepatic stellate cell

Qing-Hua Liu, Ding-Guo Li, Xin Huang, Han-Ning You, Qin Pan, Lei-Ming Xu, Qin-Fang Xu, Han-Ming Lu

Qing-Hua Liu, Ding-Guo Li, Xin Huang, Han-Ning You, Qin Pan, Lei-Ming Xu, Qin-Fang Xu, Han-Ming Lu, Department of Gastroenterology of Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092, China

Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30170411.

Correspondence to: Dr. Ding-Guo Li, Department of Gastroenterology, Xinhua Hospital, 1665 KongJiang Road, Shanghai 200092, China. Dingguo_li@yahoo.com.cn

Received: November 19, 2002
Revised: November 20, 2002
Accepted: December 9, 2002
Published online: June 15, 2003

Abstract

AIM

To investigate the effect of activin A on the extracelluar matrix secretion of rat hepatic stellate cell.

METHODS

Hepatic stellate cells were isolated and purified from normal male Sprague-Dawley rat liver by a combination of pronase-collagenase perfusion and density gradient centrifugation. Passaged hepatic stellate cells were divided randomly into eight groups: control group(A group), ACTA 1 μg/L group (B group), ACTA 10 μg/L group(C group), ACTA 100 μg/L group (D group), TGF β₁ 10 μg/L group(E group), TGF β₁ 10 μg/L plus ACTA 1 μg/L group(F group), TGF β₁ 10 μg/L plus ACTA 10 μg/L group(G group), TGF β₁ 10 μg/L plus ACTA 100 μg/L group(H group). 24 h after incubation secretion of procollagen Ⅲ, collagen Ⅳ and mRNA of collagen Ⅲ in hepatic stellate cells were detected by radioimmunoassays and semi-quantitative RT-PCR method respectively.

RESULTS

Extracellular matrix secretion in passaged hepatic stellate cells was enhanced by activin A according to its concentration, the capacity of extracellular matrix secretion by 100 μg/L activin A was equal to that of 10 μg/L TGF β₁, extracellular matrix secretion and type Ⅲ collagen mRNA expression in passaged hepatic stellate cells was enhanced by activin A and TGFβ₁ in a synergistic manner.

CONCLUSION

Activin A may contribute to hepatic fibrogenesis.

Key Words: N/A

0 引言

激活素(activin, ACT)属于转化生长因子- β(transverse growth factor-β, TGF-β)超家族, 是由两个亚单位(β_A和β_B)组成的二聚体糖蛋白, 根据亚单位组成不同可分为ACT A(β_Aβ_A)、ACT B(β_Bβ_B) 和ACT AB(β_Aβ_B), 其中以ACT A最为重要[1-3]. 近年研究表明, ACT A是肝脏生长抑制性递质, 可抑制肝细胞生长, 诱导其凋亡[4-8]. 这种特性与TGF-β₁在肝内的作用相似. 已知TGF-β₁作为重要的细胞因子参与肝纤维化形成[9-12], 关于ACT A在肝纤维化形成中所起的作用以及与TGF-β₁关系还不是很明确, 为此我们进行研究.

1 材料和方法

1.1 材料

Sprague-Dawley ♂大鼠, 质量400-450 g, 购自中国科学院上海实验动物中心, 普通饲料喂养, 自由进食. 基因重组人TGF-β1, 为R＆D公司产品; 基因重组人ACTA由日本Ajinomoto药物研究室Eto Yusuzu博士惠赠; 链酶蛋白酶、Ⅳ型胶原酶、DNA酶、Nycodenz为Sigma公司产品; DMEM培养基为Gibco公司产品; 小牛血清、胰蛋白酶、mRNA抽提试剂盒为上海华美生物工程公司产品; 逆转录试剂盒为Promega公司产品; Tag酶、琼脂糖、dNTP为上海生物工程公司产品; Ⅲ型胶原及β-actin引物由上海生物工程公司合成.

1.2 方法

采用原位酶灌注法和密度梯度离心法分离HSC[13,14]. 大鼠经2.5 g/L戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉后, 门静脉穿刺, 恒流泵以20 ml/min速度依次灌注前灌流液、链酶蛋白酶溶液和胶原酶溶液. 肝组织软化后, 分离肝脏, 剪碎后于链酶蛋白酶、胶原酶和DNA酶液中振荡消化30 min. 所得悬液200目网过滤, 滤液离心, 500 g×7 min, 弃上清, D-hanks液重复离心洗涤3次. 以1:2的体积与180 g/L Nycodenz混匀, 上覆少许DMEM培养液, 行密度梯度离心, 1500 g×7 min. 取界面处细胞, D-hanks液离心洗涤2次, 500 g×7 min. 用含200 ml/L小牛血清的DMEM培养液重悬细胞, 5-10×10⁸/L的浓度接种培养细胞, 24 h后换液, 14 d后传代. 台盼蓝排斥法鉴定细胞活率; 自发荧光观察鉴定其纯度. 取初次传代的HSC, 以含200 ml/L 小牛血清的DMEM培养液调整细胞浓度约为2×10⁸/L接种6孔板. 待细胞融合生长后, 换含10 ml/L小牛血清的DMEM培养24 h, 将细胞分为8组: (1)空白对照组(A组); (2)ACTA 1 μg/L(B组): 加ACTA浓度为1 μg/L; (3)ACTA 10 μg/L(C组): 加ACTA浓度为10 μg/L; (4)ACTA 100 μg/L(D组): 加ACTA浓度为100 μg/L; (5)TGF β₁ 10 μg/L(E组): 加TGF β₁浓度为10 μg/L; (6)ACTA 1 μg/L+TGF β₁ 10 μg/L(F组): 加ACTA浓度为1 μg/L, TGF β₁浓度为10 μg/L; (7)ACTA 10 μg/L+TGF β₁ 10 μg/L(G组): 加ACTA浓度为10 μg/L, TGF β₁浓度为 10 μg/L. (8)ACTA 100 μg/L+TGF β₁ 10 μg/L(G组): 加ACTA浓度为100 μg/L, TGF β₁浓度为 10 μg/L. 药物作用24 h后, 分别采用放射免疫法检测培养液Ⅲ型前胶原(procollagen Ⅲ, PCⅢ)、Ⅳ型胶原(collagen Ⅳ, CⅣ)含量或半定量RT-PCR方法测定细胞Ⅲ型胶原mRNA表达. PCⅢ、CⅣⅢ含量测定采用放射免疫法, 按试剂盒说明书操作.

Ⅲ胶原mRNA相对表达量RT-PCR检测: (1)RNA提取和逆转录反应按试剂盒说明书操作; (2)引物设计及扩增条件: 根据文献报道的大鼠Ⅲ型胶原及β-actin的cDNA序列, 应用Oligo引物设计软件在计算机上设计相应引物. Ⅲ型胶原: 上游, 5'-tgg cca acc agg aga gaa gg-3'; 下游, 5'-atc cgt ctc gac ctg gct ga-3', 扩增片断长300 bp. 扩增条件: 94 °C 5 min; 94 °C 1 min, 60 °C 1 min, 72 °C 1 min, 循环30次; 72 °C 7 min. β-actin: 上游, 5'-tac ccc att gaa cac ggc at-3'; 下游, 5'-tca cgc acg att tcc ctc tc-3', 扩增片断长428 bp. 扩增条件: 94 °C 5 min; 94 °C 1 min, 58 °C 1 min, 72 °C 1 min, 循环28次; 72 °C 7 min. (4)半定量分析: PCR产物在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳后摄像, 图像使用复日Smartview分析软件行密度定量, Ⅲ型胶原与β-actin比值作为Ⅲ型胶原mRNA相对表达量.

统计学处理 计量资料以表示, 多组间差异采用方差分析, 两组组间差异用Dunnett's t检验, 所有数据均用SPSS10.0软件分析.

2 结果

2.1 HSC细胞的得率和纯度

用本法分离的HSC, 其得率为5106-1107/肝, 以4 g/L台盼蓝染色细胞存活率在90%以上. 新鲜分离的HSC在波长为325-328 mm紫外线激发下, 呈明亮蓝绿色荧光(图1). 培养1 wk后, HSC完全激活, 呈梭型生长(图2).

图1 新鲜分离的HSC在紫外线激发后呈蓝绿色荧光×1100.

图2 HSC完全激活后呈梭型生长×1100.

2.2 ACTA及联合TGFβ₁对HSC分泌PCⅢ、CⅣ影响

ACTA促进HSC分泌PCⅢ型、CⅣ, 并呈剂量依赖关系(表1). 当ACTA浓度为100 μg/L时, 能显著促进HSC分泌PCⅢ、CⅣ(P<0.01). 100 μg/L ACTA促进HSC分泌ECM作用与10 μg/L TGF β₁相当(P>0.05). 不同浓度ACTA(1, 10, 100 μg/L)与TGF β₁(10 μg/L)合用引起的剂量依赖性促进HSC分泌ECM作用不仅比单独使用ACTA时作用强, 而且两药合用时HSC分泌ECM比两药理论相加值大(P<0.05)(图3、图4).

表1 不同浓度ACTA 及其与TGFβ₁合用对大鼠分泌ECM的影响.

组号	分组	PCⅢ(ng/L)	CⅣ(μg/L)
1	空白对照组	6.6±2.3	90.6±12.7
2	ACTA 1 μg/L	6.7±1.8	92.5±9.1
3	ACTA 10 μg/L	7.9±2.6	112.1±25.4
4	ACTA 100 μg/L	20.5±3.6b	240.5±47.2b
5	TGFβ1 10 μg/L	20.7±6.8b	253.1±44.3b
6	TGFβ1 10 μg/L+ ACTA 1 μg/L	23.3±7.1b	261.7±56.5b
7	TGFβ1 10 μg/L+ ACTA 10μg/L	30.1±10.7b	331.2±97.6b
8	TGFβ1 10 μg/L+ ACTA 100 μg/L	50.4±10.0b	526.3±103.1b

^bP<0.01 vs 空白对照组.

图3 ACT A及联合TGFβ1对HSC分泌PCⅢ影响.

图4 ACT A及联合TGFβ1对HSC分泌CⅣ影响.

2.3 HSC总RNA质量鉴定

用微量紫外分光光度仪检测RNA A₂₆₀/A₂₈₀介于1.8-2.0, 表明RNA未被蛋白质污染. 1%琼脂糖凝胶电泳显示28S和18S两条带(图5). 摄像后, 图像使用复日Smartview分析软件行密度定量, 28S约为18 S两倍, 说明RNA无明显降解, 可用于RT-PCR实验.

图5 RNA电泳图.

2.4 ACT A及联合TGFβ₁对大鼠HSCⅢ型胶原mRNA表达影响

10 μg/L TGFβ₁能显著增加HSC分泌Ⅲ型胶原mRNA(52.6±5.1 % vs 23.4±3.5 %, P＜0.01), 10 μg/L ACT A对其影响不明显(25.1±6.5%), 但是联合10 μg/L TGF β₁后促进HSC分泌Ⅲ型胶原mRNA较二者理论相加值大(66.1±8.2%, P<0.05)(图6、表2).

表2 ACTA 及其与TGFβ₁合用对大鼠HSCⅢ型胶原mRNA影响.

组号	分组	Ⅲ型胶原mRNA(%)
1	空白组	23.4±3.5
3	ACTA 10 μg/L	25.1±6.5
5	TGFβ1 10 μg/L	52.6±5.1b
7	TGFβ1 10 μg/L+ ACTA 10 μg/L	66.1±8.2 b

^bP<0.01 vs 空白对照组.

图6 10 μg/L ACTA 及其与10 μg/L TGFβ₁合用对大鼠HSCⅢ型胶原mRNA影响.

3 讨论

我们研究证实了ACTA能刺激体外培养HSC分泌ECM, 在一定浓度范围内(1-100 μg/L)呈剂量依赖关系; 100 μg/L ACT A刺激HSC分泌ECM的能力与10 μg/L TGF-β₁相当, 而且ACT A能协同TGF-β1发挥这一生物学效应. Sugiyama et al[15]研究发现在二甲基亚硝胺和猪血清诱导的大鼠肝纤维化模型中ACTA表达增高, 首次证实除TGF- β₁外, 这一家族其他成员ACTA在肝纤维化组织中过量表达; 我们的研究也显示正常肝脏能够表达ACT A, 在肝纤维化形成过程中其表达一过性下降, 然后又逐渐升高[16,17], 这些资料均显示ACTA可能参与肝纤维化形成.

HSC在肝损伤过程中被激活经表型转化而成为肌成纤维细胞, 产生大量ECM促进肝纤维化形成, 是肝纤维化发生发展的中心环节, 体外培养HSC常作为肝硬化基础及实验治疗研究的重要手段[18-26]. ECM过度沉积是肝纤维化形成中关键的一步, 检测ECM成分的含量常作为肝纤维化的辅助诊断手段[12,27]. 目前认为PCⅢ, CⅣ, 层粘连蛋白及透明质酸是最具代表性的肝纤维化血清学指标. 肝纤维化时, HSC胶原mRNA表达增加, 特别是Ⅰ, Ⅲ型胶原[28,29]. 因此, 在实验中我们采用体外培养的HSC作为研究的靶细胞, 用放射免疫检测培养细胞上清液PCⅢ、CⅣ含量及细胞Ⅲ型胶原mRNA表达. 我们研究证实随着ACT A浓度增加, 其促进HSC分泌ECM能力增加. 在1-100 μg/L剂量范围内, 以100 μg/L促进HSC分泌PCⅢ, CⅣ能力最强(P<0.01); 在10 μg/L ACT A时对HSC表达Ⅲ型胶原mRNA影响不明显, 当联合10 μg/L TGF β₁后, 其促进HSC表达Ⅲ型胶原mRNA较二者理论相加值大(P<0.05), 说明二者具有协同作用. 在肝星状细胞表面存在ACTA受体, 其结构与TGF-β₁受体相似, 均属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 有3种形式, 即Ⅰ型受体(RⅠ)、Ⅱ型受体(RⅡ)和Ⅲ型受体(RⅢ). 在信号转导时, ACTA, TGF-β₁分别与各自的RⅡ结合, 然后激活各自的RⅠ, 由RⅠ向细胞内转导生物学信息变化; RⅢ因缺乏细胞内区, 不是信号转到所必需[30-36]. 在HSC表面分别存在ACTA与TGF-β₁两种受体, 其生物学活性相似, 但又各自独立. 我们的研究证实ACTA协同TGF-β₁刺激HSC分泌ECM, 共同参与肝纤维化形成.

备注

$[Footnotes]

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