ONO-3403对胆囊收缩素刺激的大鼠胰腺外分泌的影响

摘要

目的

观察新型蛋白酶抑制剂ONO-3403对进食大鼠基础的及CCK-8刺激的胰腺外分泌功能的影响, 探讨ONO-3403增加胰腺外分泌的机制.

方法

对进食的Wistar大鼠, 分别于实验前6 h和12 h经胃管给与ONO-3403(20 ug/kg)后收集基础的和静脉注射CCK-8后的胰液, 并对胰腺组织进行匀浆处理. 用Lowry法、产色素法和Whitaker法, 分别测定胰液及胰腺组织中的蛋白含量, 淀粉酶和脂肪酶含量.

结果

⑴基础的及CCK-8刺激的12 h组的胰液容积(峰值 215±9 ulper 30 min vs 93±6 ulper 30 min, P<0.01), 蛋白含量(峰值16 475±1801 ug per 30 min vs 5920±593 ug per 30 min, P<0.01), 均较对照组明显增加. 而6 h组无显著变化. ⑵基础胰液中淀粉酶含量(6 h组470±32 su per 30 min P<0.01, 12 h组394±47 su per 30 min P<0.05 , 较对照组251±32 su per 30 min明显增加), HCO₃^-含量 (6 h组2.224±0.333 umolper 30 min P<0.05, 12 h组3.148±0.374 umolper 30 min P<0.01, 较对照组1.428±0.282 umolper 30 min明显增加).而脂肪酶无显著的变化. ⑶6 h组和12 h组的胰腺质量及胰腺组织中蛋白质, 淀粉酶含量均无显著变化(P>0.05).

结论

ONO-3403能增加进食大鼠的胰腺外分泌及对CCK-8刺激的敏感性, 其机制可能是通过CCK调节的胰腺反馈而起作用的.

关键词: N/A

Effects of protease inhibitor ONO-3403 on pancreatic exocrine response to CCK in rats

Shao-Fu Chen, Wei-Xin Liu, Mitsuyoshi Yamamoto, Otsuki Makoto

Shao-Fu Chen, Department of Gastroenterology, Second Clinical College, China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China

Wei-Xin Liu, Department of Gastroenterology, First clinical college, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China

Mitsuyoshi Yamamoto, Otsuki Makoto, Third Department of Internal Medicine, School of Medicine, University of Occupational and Environmental Health, Kitakyushu 807, Japan

Correspondence to: Dr. Shao-Fu Chen, Department of Gastroenterology, Second Clinical College, China Medical University, 36 Shanhao Street, Shenyang 110004, Liaoning Province, China. csf196211@yahoo.com.cn

Received: October 8, 2002
Revised: October 20, 2002
Accepted: October 29, 2002
Published online: June 15, 2003

Abstract

AIM

To examine the pancreatic exocrine response to CCK-8 and to clarify the mechanism of the pancreatic exocrine hypersecretion after oral administration of synthetic protease inhibitor ONO-3403 in rats.

METHODS

A single oral dose of synthetic protease inhibitor ONO-3403 was given to rats by orogastric tube 6h and 12 h before experiments. The pancreatic juice was collected before test and after stimulation of stepwise increasing doses of CCK-8. The output of protein, amylase, lipase and bicarbonate in pancreatic juice or pancreatic tissue were determinated by Lowry method, Chromogenic method with blue-dyed starch polymer, Whitaker method and by the DST 800 multititration system, respectively.

RESULTS

Oral administration of ONO-3403 had no influence on pancreatic juice flow and output of protein in basal and CCK-8 stimulation at 6h after ONO-3403 pretreated, but it caused a significant increase in pancreatic juice flow (peak level 215±9 ulper 30 min vs 93±6 ulper 30 min, P<0.01) and protein output (peak level 16475±1 801 ug per 30 min vs 5 920±593 ug per 30 min, P<0.01) of the basal and CCK-8 stimulation at 12 h after ONO-3 403 pretreated. The basal pancreatic juice flow and output of amylase (470±32 su per 30 min at 6 h P<0.01, 394±47 su per 30 min at 12 h, P<0.05 vs 251±32 su per 30 min), bicarbonate (2.224±0.333 umolper 30 min at 6 h, P<0.05; 3.148±0.374 umolper 30 min at 12 h, P<0.01 vs 1.428±0.282 umolper 30 min) were significant high after ONO-3403 pretreated than those of control group. There was no change in lipase output compared with control group. The pancreatic weight, pancreatic contents of protein and amylase in ONO-3 403 pretreated rats were similar to those in control rats.

CONCLUSION

ONO-3 403 can increase pancreatic exocrine secretion and sensitivity to CCK-8 stimulation.The mechanism of ONO3 403 induced pancreatic exocrine hypersecretion may be a feedback regulation of the pancreas by increasing CCK secretion.

Key Words: N/A

0 引言

已被证实在小肠近端的胰蛋白酶和糜蛋白酶对胰腺的外分泌起负反馈作用[1-5]. 有报道显示[6-8], 向十二指肠内输入人工合成的蛋白酶抑制剂camostat能引起肠腔内蛋白酶的抑制, 而使血浆胆囊收缩素(CCK)浓度升高, 并能刺激胰腺的外分泌, 因此推测CCK在胰蛋白酶对胰腺外分泌的反馈调节中起主导作用.我们选择一种新型的蛋白酶抑制剂ONO-3403, 他在抑制蛋白酶活性方面比camostat强5-10倍, 作用时间更长[9]. 在我们先前的实验已经证实ONO-3403能增加进食大鼠的胰腺外分泌及对胰泌素刺激的敏感性[10], 其机制可能是通过CCK调节的胰腺反馈而起作用的.本实验进一步观察大鼠口服ONO-3403后, 是否能促进胰腺外分泌及增加对CCK刺激的敏感性, 以寻找ONO-3403对胰腺外分泌的作用机制及与胰腺外分泌相应的负反馈机制. 蛋白酶抑制剂在急, 慢性胰腺炎的治疗中起重要的作用[11-18], 探讨新型蛋白酶抑制剂对胰腺的作用机制有较重要的意义.

1 材料和方法

1.1 材料

♂wistar大鼠, 体重250-300 g, 大鼠饲养在23 °C, 12 h明暗交替的环境中, 可以自由的饮水和获得标准的饲料饮食.药物ONO-3403(ethylN-allyl-N-|(E)-2-methyl-3-[4-amino-phenoxy(arbonyl)phenyl]propenoyl | amino acetate methansulfonate)是一种人工合成的蛋白酶抑制剂, 由日本小野制药公司提供, 实验前用蒸馏水溶解并调整pH至6.4备用. 胆囊收缩素(CCK-8)购自日本大阪肽蛋白研究所.

1.2 方法[19-23]

将大鼠30只随机分成3组, 每组10只, 即对照组可自由的饮食水, 不给予ONO-3403; 6 h组和12 h组分别于实验开始前6 h和12 h, 经胃管将ONO-3403(20 ug/kg)灌入大鼠胃内, 亦可自由的饮食水. 实验开始先用Urethare(1.6 g/kg)腹腔注射麻醉后, 剥离出颈内静脉, 用聚乙烯导管插入颈内静脉, 以备注射CCK-8. 行腹正中切口, 结扎幽门, 行胆管和胰管插管, 胆管在肝门的下方和胰腺的近端结扎, 将插入胆管的聚乙烯导管引入十二指肠, 保持在整个实验过程中胆汁流入十二指肠, 在总胆胰管的远端近十二指肠入口处插入胰管插管, 以获得纯净的胰液, 每30 min收集1次胰液. 在1 h的平衡期后, 先收集30 min的基础胰液, 然后进行CCK-8的剂量反应的研究, 每30 min阶梯式增加CCK-8的剂量, 分别为62.5, 125, 250, 500, 1 000, 2 000, 4 000 ng/(kg·h), 以2 mL/h的速度经颈内静脉输入体内, 收集每个剂量的CCK-8刺激下的胰液, 以备测定胰液的容积, 蛋白含量, HCO₃^-的含量及淀粉酶, 脂肪酶的含量.上述实验结束后, 通过放血法处死大鼠, 迅速切除胰腺, 清除其中的淋巴结, 脂肪组织后, 称其质量, 切除约300 mg的胰腺组织, 放入-70 °C冰箱中保存, 以备测定胰腺组织中蛋白和淀粉酶的含量. 测定前, 切取胰腺组织的一部分, 用组织匀浆器, 2 000 r/min, 在4 °C 0.15 mol/L的氯化钠溶液中进行胰腺组织匀浆. 胰液及胰腺组织中蛋白含量用Lowry法测定, 使用小牛血清蛋白为标准品.淀粉酶含量用产色素法测定, 以Somogyi单位表示. 脂肪酶含量用Whitaker法测定, 以国际单位(IU)表示. HCO₃^-含量用DST800多样分析系统(radiometer, copenhagen, denmark), 在采集胰液后迅速进行检测[24,25].

统计学处理 数据均用mean±SD表示, 用两个样本均数差异的t检验法, 进行显著性检验.

2 结果

2.1 ONO-3403对基础的和CCK-8刺激的胰液容积的影响

6 h前给与ONO-3403的大鼠胰液容积与对照组相比没有明显的变化, P>0.05. 而12 h前给与ONO-3403的大鼠胰液容积与对照组相比, 无论基础的和CCK-8刺激的胰液容积均明显增加, P<0.05或P<0.01, 并在CCK-8浓度500 ng/(kg·h)时胰液容积达高峰为215.8±9.1 μL/30 min, 以后逐渐下降至与对照组相同水平, 提示ONO-3403能增加进食大鼠的胰液外分泌, 但起作用的时间延迟至12 h, 而在6 h并未起作用(表1).

表1 ONO-3403对基础的和CCK-8刺激的胰液容积的影响(μL/30 min).

分组	CCK-8剂量ng/(kg.H)
	0	62.5	125	250	500	1 000	2 000	4 000
对照组(n = 10)	27.5±2.8	34.4±2.4	50.2±2.9	74.1±7.4	93.6±6.6	108±9.5	104.6±8.3	88.5±8.1
6 h组(n = 10)	32.6±3.1	62.2±8.0	99.5±14.5	136.4±15.3	171.2±13.8	173.1±16.7	147.3±9.5	102±6.9
12 h组(n = 10)	59.2±7.1a	103.2±11.0a	145.8±7.1a	169.2±9.7a	215.8±9.1a	201.8±11.2a	167±19.6b	116±24.4

^aP<0.01 vs 对照组;

^bP<0.05 vs 对照组.

2.2 ONO-3403对基础的和CCK-8刺激的胰液蛋白含量的影响

6 h前给与ONO-3403的大鼠胰液蛋白含量与对照组相比略有增加, 但差异不显著, P>0.05. 而12 h前给与ONO-3403的大鼠胰液蛋白含量与对照组相比, 无论基础的和CCK-8刺激的均明显增加, P<0.05或P<0.01, 并在CCK-8浓度500 ng/(kg·h)时胰液蛋白含量达高峰为16475±1801.6 μg/30 min, 以后逐渐下降至与对照组相同水平, 提示ONO-3403能增加进食大鼠的胰液外分泌中的蛋白含量, 但起作用的时间延迟至12 h, 而在6 h并未起作用. 说明胰液蛋白含量增加与胰液容积增加是同步的(表2).

表2 ONO-3403对基础的和CCK-8刺激的胰液蛋白含量的影响(μg/30 min).

分组	CCK-8剂量ng/(kg.h)
	0	62.5	125	250	500	1 000	2 000	4 000
对照组(n = 10)	237.6±8.9	929.3±119.2	2486.3±411.5	4668.4.1±625.2	5 920.7±593.7	7539.4±1041.5	7424.8±749.6	5316.9±626.2
6 h组(n = 10)	356.1±47.8	3228.5±926.7	7004.9±1091.5	8975.1±943.1	9531±740.3	6186.7±548.8	3967.2±412.4	2818.3±389.8
12 h组(n = 10)	425.1±73.9a	4 672.6±728.4a	9 055.8±700.3a	13 038.4±952.6a	16 475±1 801.6a	13 140±2 067.9a	9630.2±1708.9b	5659.8±893.8

^aP<0.01 vs 对照组;

^bP<0.05 vs 对照组.

2.3 ONO-3403对基础胰液中淀粉酶、脂肪酶和HCO₃^-含量的影响

6 h前和12 h前给与ONO-3403的大鼠基础胰液中淀粉酶含量和HCO₃^-含量与对照组相比均明显增加, 二者差异显著, P<0.05或P<0.01. 而基础胰液中脂肪酶含量6 h组和12 h组与对照组相比无明显的变化, P>0.05. 提示ONO-3403能增加进食大鼠的基础胰液中淀粉酶和HCO₃^-含量, 并在给药后6 h开始起作用, 而脂肪酶含量无明显变化或可能在给药12 h以后才能起变化. 说明ONO-3403能增加基础胰液外分泌中胰酶的含量(表3).

表3 ONO-3403对基础胰液中淀粉酶、脂肪酶和HCO₃^-的影响.

分组	淀粉酶(su/30min)	脂肪酶(u×103/30min)	HCO3-(mmol/30 min)
对照组(n = 10)	251.5±32.5	290.5±58.3	1.428±0.282
6 h组(n = 10)	470.2±56.3a	288.7±13.6	2.224±0.333b
12 h组(n = 10)	394.5±47.3b	287.3±24.7	3.148±0.374a

^aP＜0.01 vs对照组;

^bP＜0.05 vs 对照组.

2.4 ONO-3403对胰腺重量, 胰腺组织中的蛋白含量和淀粉酶含量的影响

6 h前和12 h前给与ONO-3403的大鼠胰腺重量和胰腺蛋白含量与对照组相比有增加的趋势, 但差异不显著, P>0.05. 而胰腺淀粉酶含量6 h组和12 h组与对照组相比亦无明显的变化, P>0.05(表4).

表4 ONO-3403对胰腺质量、胰腺蛋白和淀粉酶含量的影响.

分组	胰腺质量(mg)	蛋白含量(mg/pancreas)	淀粉酶含量(103×su/pancreas)
对照组(n = 10)	995.1±54.3	189.5±12.5	1194.6±179.3
6 h组(n = 10)	1052.6±53.2	196.3±15.6	737.2±43.8
12 h组(n = 10)	1096.2±42.4	217.5±21.9	855.6±75.8

P>0.05 vs 对照组.

3 讨论

单位时间内胰液容积, 胰液蛋白含量, 淀粉酶含量, 脂肪酶含量及HCO₃^-含量的变化能反映胰液外分泌的变化.蛋白质、淀粉酶和脂肪酶由胰腺腺泡细胞分泌, 水和HCO₃^-由胰管上皮细胞分泌. CCK既能作用于胰腺腺泡细胞, 促进其分泌胰酶; 也能作用于胰管上皮细胞, 促进其分泌水和HCO₃^-[26,27]. 本研究表明, ONO-3403能增加进食大鼠胰液流量、胰液淀粉酶、蛋白质及HCO₃^-的分泌, 并能增强胰腺对CCK刺激的敏感性而使胰腺外分泌增加. 其机制可能是通过CCK调节的胰腺反馈而起作用的.

在进食大鼠的十二指肠内有较多的蛋白酶底物即食物蛋白, 此状态下的胰腺外分泌较空腹时强, 分泌至十二指肠腔内的蛋白水解酶的活性较高, 口服蛋白酶抑制剂ONO-3403后在十二指肠内抑制了蛋白水解酶的活性, 而使肠腔内蛋白未能充分代谢, 蛋白可刺激CCK的释放, CCK可促进胰腺外分泌增加, 包括胰液流量, 蛋白含量, 淀粉酶含量, HCO₃^-含量, 但脂肪酶未见明显变化. 胰腺的这一负反馈机制可能是通过肠腔内的多种内源性的CCK释放肽而引起的, 其中一种称为监视肽(monitor peptide, MP)[28], 由胰腺分泌至胰液中, 其他CCK释放肽由小肠分泌至肠腔内, 如腔内CCK释放因子(LCRF)[29]和diazepam-binding inhibitor(DBI)[30]. 这些CCK释放肽都对胰蛋白酶敏感, 可被其降解. 当经胃管给与ONO-3403后, 抑制了十二指肠内蛋白酶的活性, 使这些CCK释放肽的降解减少, 促进了CCK的释放, 而使胰腺外分泌增强.

给与ONO-3403 6 h胰腺外分泌增加的强度与给与ONO-3403 12 h相比较弱, 说明ONO-3403对进食大鼠的作用延迟. 对这一延迟作用的现象, 我们推测, 在口服ONO-3403后, 降低了十二指肠内蛋白酶的活力或直接作用于小肠的CCK产生细胞, 使CCK的产生明显增加. CCK刺激胰酶的分泌, 包括MP和胰蛋白酶, 糜蛋白酶同时进入十二指肠.在空腹状态下, 这些蛋白水解酶使MP, LCRP和DBI水解失活, 这样就进一步抑制了CCK的释放, 而在进食状态下, 食物蛋白能与CCK释放肽竟争胰蛋白酶和糜蛋白酶, 使CCK释放肽失活减少, 能持续刺激CCK的释放, 而产生延迟胰腺外分泌增加.对这种延迟反应的另一种推测是进食的大鼠胃内食物延迟了ONO-3403向十二指肠的排空, 使其抑制胰酶的作用延迟, 进而使胰腺外分泌增加延迟.

CCK是小肠黏膜中CCK产生细胞分泌的一种激素[31], 其重要的生理作用是刺激胰腺的腺泡细胞分泌胰酶等物质[32], 在给与蛋白酶抑制剂ONO-3403后, 胰腺外分泌对CCK的敏感性与对照组相比明显增强, 说明ONO-3403能使内源性CCK分泌增强, 加上外源性CCK, 提高了CCK的血浓度, 使胰腺外分泌明显增加. CCK浓度的增加可使胰腺组织水肿, 产生炎症, 胰腺质量的增加是胰腺炎症水肿的标志[33]. 我们的实验证明给与ONO-3403后大鼠的胰腺质量, 胰腺蛋白含量和胰腺淀粉酶含量与对照组相比无明显变化, 说明经口给与ONO-3403后不能造成胰腺明显水肿, 不能使胰腺淀粉酶和蛋白质的合成减少.

本研究表明, 蛋白酶抑制剂ONO-3403能刺激进食大鼠的胰腺外分泌, 使胰腺外分泌对CCK的敏感性增加, 这一反应的机制可能是十二指肠内CCK释放肽失活减少, 使CCK产生增加, 而使胰腺外分泌增加.

备注

$[Footnotes]

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