肝癌 Open Access
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世界华人消化杂志. 2003-06-15; 11(6): 716-718
在线出版日期: 2003-06-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i6.716
大鼠肝细胞癌形成过程中MMP-2mRNA的表达及应用BB-94的影响
张志, 方石岗, 高毅, 蒋泽生, 孙尔维
张志, 高毅, 蒋泽生, 孙尔维, 中国人民解放军第一军医大学珠江医院器官移植科 广东省广州市 510282
张志, 男, 1980-11-08生, 江西省湖口市人, 汉族, 2001年第一军医大学本科毕业, 现为第一军医大学珠江医院器官移植科硕士研究生.
方石岗, 中国人民解放军第一军医大学珠江医院普通外科 广东省广州市 510282
基金项目: 广东省自然科学基金课题, No. 974053.
通讯作者: 方石岗, 510282, 广东省广州市工业大道中253号, 中国人民解放军第一军医大学珠江医院普通外科. mshiji@hotmail.com
电话: 020-61643402
收稿日期: 2002-07-26
修回日期: 2002-08-30
接受日期: 2002-11-04
在线出版日期: 2003-06-15

目的

观察肝癌形成过程中MMP-2mRNA表达的动态变化, 探索明胶酶在肝癌生长浸润中的作用. 应用明胶酶抑制剂Batimastat (BB-94)进行治疗, 观察其对明胶酶mRNA表达的影响.

方法

应用RT-PCR法对大鼠肝癌形成过程中各期MMP-2mRNA表达情况进行观察, 并与Batimastat治疗组和正常对照组进行统计分析.

结果

诱癌过程中早期肝硬化期MMP-2mRNA表达成缓慢增高趋势, 至癌变期表达明显较增高, 并呈一平台. 诱癌不同时期应用BB-94对MMP-2mRNA相对表达值无影响.

结论

诱癌过程中MMP-2mRNA表达持续升高. BB-94治疗对MMP-2mRNA的表达没有影响.

关键词: N/A
引文著录: 张志, 方石岗, 高毅, 蒋泽生, 孙尔维. 大鼠肝细胞癌形成过程中MMP-2mRNA的表达及应用BB-94的影响. 世界华人消化杂志 2003; 11(6): 716-718
Effect of batimastat on Matrix metallopro-teinase-2 mRNA in rat hepatocellular carcinoma
Zhi Zhang, Shi-Gang Fang, Yi Gao, Ze-Sheng Jiang, Er-Wei Sun
Zhi Zhang, Yi Gao, Ze-Sheng Jiang, Er-Wei Sun, Department of Organ Transplantation, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province China
Shi-Gang Fang, Department of general surgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province China
Supported by: the Natural Scientific Foundation of Guangdong Province, No. 974053.
Correspondence to: Dr. Shi-Gang Fang, Department of general surgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province China. mshiji@hotmail.com
Received: July 26, 2002
Revised: August 30, 2002
Accepted: November 4, 2002
Published online: June 15, 2003

AIM

To study the dynamic changes of matrix metalloproteinase-2 mRNA in liver tissue during the experimental hepatocarcin-ogenesis and the effect of Batimastat on it.

METHODS

Hepatocellular carcinoma was induced with the administration of diethy Initrosoamine(DENA) in rats. BB-94 was intraperitoneally injected to treat the experimental models. Reverse transcription polymerase chain reaction was used for quantitative analysis of MMP-2 mRNA expression level during the induction and therapy.

RESULTS

The expression of MMP-2mRNA was increased throughout the hepatocarcinogenesis, and reach had its maximum plateau in the early hepatocarcinogenesis stage. BB-94 no effect on MMP-2mRNA expression.

CONCLUSION

MMP-2mRNA expression is increasing during hepatocarcinogenesis, and BB-94 has no effect on MMP-2mRNA expression.

Key Words: N/A
0 引言

研究表明, 明胶酶A(基质金属蛋白酶2, matrix metall-oproteinase-2, MMP-2)可以降解细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的主要成分IV型胶原, 在肿瘤组织中呈高表达, 对肿瘤的发展和转移起重要作用[1-4]. 我们前期的研究证明, 在肝癌形成过程中, MMP-2在酶原及酶活性水平呈逐渐升高的趋势[5]. 为进一步揭示其变化规律, 我们从mRNA水平观察了肝癌形成过程中MMP-2的动态变化, 同时应用MMP-2的抑制剂Batimastat(BB-94)进行治疗, 观察其对MMP-2 mRNA表达的影响.

1 材料和方法
1.1 材料

清洁Wistar大鼠, 124只, 体质量130-150 g, 第一军医大学动物实验中心提供, 随机分为正常组(28只), 诱癌模型对照组(56只)及BB-94治疗组(40只), 应用经典的二乙基亚硝胺(DENA)(动物学报 1996; 42: 166-170)诱导肝癌模型. 正常组及诱癌组各平均分成7个亚组, 于诱癌0, 4, 8, 12, 16, 20, 24 wk各处死1个亚组, 取肝左叶液氮保存. 治疗组40只大鼠平均分为4个亚组, 在造模8, 12, 16, 20 wk分别选取一个亚组每日予BB-94悬液(英国牛津生物技术公司惠赠)腹腔注射(30 mg/kg), 用药4 wk. 于24 wk处死各亚组大鼠, 取肝左叶液氮保存.

1.2 方法

取液氮保存的肝组织约50-100 mg, 加入Trizol溶液1 mL匀浆, 放入1.5 mL Eppendorf管中, 室温放置5 min, 加入氯仿200 μL混匀, 室温放置15 min, 11 000 r/min, 2-8 °C离心15 min, 取水相, 加入异丙醇0.5 mL混匀, 室温放置10 min, 11 000 r/min, 2-8 °C离心10 min后7000 r/min, 2-8 °C离心5 min, 弃上清空气干燥5-10 min, DEPC水100 μL溶解提取物, 取10 μL作纯度和定量分析, 余-10 °C保存备用. 采用紫外分光光度计检测提取物, 计算RNA浓度(A260, 核酸稀释倍数*40/1000, A260/A280>1.8). 取1 μg RNA提取物, 加入5倍逆转录缓冲液5 μL, 10 mmol/L dNTP 2 μL, Oligo(dt)15 primer 50 mg/L, 混匀, 65 °C变性5 min, 室温加入M-MLV逆转录酶200 μ, 0.1MDTT 2 μL, RNAsin 20 μ, DEPC水补至总体积25 μL, 37 °C逆转录1 h, 95变性5 min, 取cDNA10 μL 行PCR扩增. β-actin上游引物: 5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3', 下游引物: 5'-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3'. MMP-2上游引物: 5'-TTCTTCAAGGACCGGTTATTTGG-3', 下游引物: 5'- CTTCTTCACTTCATTGTATCTCCA-3'. PCR条件: 10倍PCR缓冲液5 μL, 4 dNTP 10 nmol, 引物各25 pmol, 逆转录产物10 μL, 总体积50 μL, 加灭菌石蜡油50 μL, 95 °C变性5 min, 80 °C 3 min, 加Tap酶1Μ. 94 °C 50 s, 56 °C 70 s, 72 °C 90 s, 循环30次, 循环结束后72 °C延伸10min. MMP-2, β-actin引物基因扩增条带大小分别为330 bp和120 bp. 取PCR产物8 μL经10 g/L琼脂糖电泳, 紫外线灯下观察见330 bp和120 bp条带(参照基因产物), 凝胶图像吸光密度分析系统进行PCR产物条带扫描定量分析, 同时拍照保存.

统计学处理 试验结果应用SPSS 8.0进行处理, 计量资料行单因素方差分析, LSD法进行组间检验, 两组间率的比较用x2检验.

2 结果

在诱发大鼠肝癌过程中, 早期肝硬化期MMP-2mRNA表达缓慢增高, 而至癌变期(16 wk)表达明显较增高, 并呈一平台. (表1). 采用单因素方差分析治疗各组和诱癌各组之间MMP-2相对表达值无明显差异, 说明BB-94治疗对MMP-2mRNA的表达无影响(表2).

表1 MMP-2灰度值/β-actin灰度值(mean±SD).
t /wk诱癌组(n =8)正常对照组(n =4)
04.28±0.984.37±0.85
44.32±0.874.31±0.76
88.44±1.56ac4.47±0.85
1211.89±1.88ac4.35±0.79
1624.21±2.58ac4.43±0.97
2026.31±3.15ac4.56±0.95
2425.67±3.01ac5.01±1.02
aP<0.05 vs 同期正常对照;
cP<0.05 vs 前期试验组.
表2 第24周各组大鼠MMP-2/β-actin mRNA灰度值相对表达量(mean±SD).
组别nMMP-2相对表达值
诱癌组825.7±3.0
治疗组
8 wk给药组1024.5±3.0
12 wk给药组1026.3±3.2
16 wk给药组1025.1±2.9
20 wk给药组1026.2±3.5
3 讨论

本实验结果表明在诱癌过程中MMP-2mRNA呈持续增高趋势. 与Benyon et al[6]的研究结果一致, 肝硬化期MMP-2mRNA轻度升高至正常对照的3-4倍. 此时, 肝细胞坏死后肝脏行组织修复, 胶原等细胞外基质(extracellular matrix, ECM)增生沉积, 同时, ECM的降解吸收也上调, 在此过程中MMP-2起关键作用. 我们的前期研究也证明, 肝硬化形成过程中, MMP-2的酶原和活性形式均升高; 肝硬化的形成与MMP-2降解IV型胶原增多有密切的关系[7-9]. 与Takahara et al[10]的结果不同, 本实验显示, 肝硬化形成期, MMP-2的表达从mRNA水平即开始升高, 并非MT1-MMP激活MMP-2增多所致.

已经证实, MMP-2在多种肿瘤的侵袭转移中起到重要作用[11-14]. 国内外众多研究指出, 在肝细胞癌中, MMP-2蛋白水平亦呈高表达, 与肝肿瘤侵袭转移的关系极为密切[5,15-19]. 而针对MMP-2的BB-94治疗, 能起到减小癌肿面积的效果; 同时, Yamamoto et al[2]也发现, 在肝癌细胞的培养上清中, 可以检测到活性MMP-2分子; 而肝癌形成过程中MMP-2mRNA表达的变化, 国内外未见报道. 本研究结果提示, 肝细胞癌形成和侵袭转移过程中, MMP-2表达升高起自mRNA水平, 自非典型增生期开始, MMP-2mRNA表达即已较肝硬化期明显升高. 非典型增生的细胞, 已经具有了某些癌细胞的生物学行为, 从基因表达水平为肿瘤的进一步发展作准备. 至早期癌变期及肿瘤演进期(相当于诱癌第16, 20, 24周)肝癌组织中的MMP-2mRNA表达继续升高至正常的5-7倍. 肝癌细胞主动表达MMP-2, 对于其快速生长和侵袭转移有重要意义[1,2,20-24].

值得注意的是, MMP-2mRNA表达量在肝癌形成后即成一平台, 表明MMP-2的表达与肿瘤的生长时间、肿瘤的大小无关; 而Arii和Ogata的研究也证明, 低分化肝癌MMP-2mRNA表达高于高分化肝癌; Ogata还提出, 肝癌细胞表达MMP-2与否, 可纳入肝癌分级的标准[25,26]; 所以, MMP-2mRNA表达的水平, 可能仅与肿瘤的分化程度有关.

BB-94是第一个在肿瘤模型治疗中广泛应用的MMPs抑制剂. 在裸鼠肠壁大肠癌种植转移模型中, BB-94的治疗能够抑制肿瘤生长和侵袭转移[27]. BB-94能控制黑色素瘤转移, 明显减少B16-BL6鼠腹腔注射黑色素瘤细胞后肺转移灶的数量和大小[28,29].

我们前期试验结果表明, 近期BB-94治疗可以明显缩小癌结节的面积[30]. BB-94能阻断酶原型MMP-2的活化, 可通过降低MMP-2的活性来抑制肝癌的生长和转移. Kinoshita et al[30]研究表明膜型金属蛋白酶(membrane type MMP, MTI-MMP)是MMP2的直接激活剂, MMP-2的前导肽被MT1-MMP切除后而激活, 这一过程可被组织金属蛋白酶抑制因子和BB-94阻断. 有报道指出, BB-94可以直接与活性MMP-2的钙离子结合部位结合, 从而达到直接抑制活性MMP-2的效果[31]. 以上结果均提示, BB-94能够从蛋白水平抑制MMP-2的活性. 但其作用起始是否可以追溯到mRNA表达调节水平, 是否能够减少MMP-2mRNA的表达; 抑或, 由于肿瘤转移是一个极其复杂的调节过程, 抑制MMP-2的蛋白活性是否会导致肿瘤细胞代偿性表达MMP-2mRNA升高？目前国内外没有这方面的研究报道.

从本实验的结果来看, BB-94治疗对肝癌组织表达MMP-2mRNA的量没有影响. 说明, BB-94治疗仅仅是从蛋白激活水平起作用, 对MMP-2转录和翻译水平没有正向或负向的调节作用. 但这个结果是否意味着肝癌细胞表达MMP-2mRNA的量只受肿瘤分化程度的作用, 而不受外界细胞接触、MMP-2活性浓度等反馈调控的影响, 则有待进一步观察研究和讨论.

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