基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2003-05-15; 11(5): 565-568
在线出版日期: 2003-05-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i5.565
大蒜素对大鼠溃疡性结肠炎淋巴细胞凋亡及其调控蛋白的影响
徐细明, 于皆平, 何小飞, 李军华, 郑敏, 於亮亮
徐细明, 于皆平, 李军华, 於亮亮, 武汉大学人民医院消化内科 湖北省武汉市 430060
徐细明, 男, 1976-08-06生, 湖北省武汉市人, 汉族, 武汉大学人民医院消化内科硕士研究生, 主要从事溃疡性结肠炎的基础与临床研究.
何小飞, 咸宁医学院附属医院消化内科 湖北省咸宁市 437100
郑敏, 咸宁医学院中心实验室 湖北省咸宁市 437100
基金项目: 湖北省教育厅基金资助课题, No. 2002A04006.
通讯作者: 何小飞, 437100, 湖北省咸宁市, 咸宁医学院附属医院消化内科. doctorhe120@hotmail.com
电话: 0715-8255334-2201
收稿日期: 2002-10-09
修回日期: 2002-10-20
接受日期: 2002-10-22
在线出版日期: 2003-05-15

目的

通过观察大鼠溃疡性结肠炎淋巴细胞凋亡及其调控蛋白Bcl-2和Bax的表达及大蒜素对其的影响, 探讨大蒜素(Allitridi, Alt)对溃疡性结肠炎肠黏膜的保护作用及其机制.

方法

用三硝基苯磺酸(TNBS)建立大鼠溃疡性结肠炎模型.将动物随机分为空白对照组(Normal group)、三硝基苯磺酸组(TNBS group)、三硝基苯磺酸+生理盐水组(TNBS+NS group)、三硝基苯磺酸+大蒜素组(TNBS+Alt group)四组. 利用DNA缺口末端标记技术(TUNEL法)和Bcl-2、Bax蛋白免疫组化染色, 分别检测溃疡性结肠炎大鼠肠组织中的淋巴细胞凋亡和淋巴细胞Bcl-2和Bax的表达, 生化检测一氧化氮(NO)含量, 并观察肠道大体形态和组织学改变.

结果

和三硝基苯磺酸组相比, 三硝基苯磺酸+大蒜素组中淋巴细胞凋亡增加(2.1±1.0 vs 5.9±2.0, P<0.01), Bcl-2表达阳性淋巴细胞减少及一氧化氮(NO)含量下降(10.0±2.5 vs 31.0±6.0, 197±11 vs 523±40, P<0.01).损伤指数明显下降(1.6±0.5 vs 5.8±0.7, 2.1±0.6 vs 6.1±0.6, P<0.01).

结论

大蒜素可以通过促进淋巴细胞凋亡和清除NO自由基而对TNBS诱导的溃疡性结肠炎肠黏膜有保护作用.

关键词: N/A
引文著录: 徐细明, 于皆平, 何小飞, 李军华, 郑敏, 於亮亮. 大蒜素对大鼠溃疡性结肠炎淋巴细胞凋亡及其调控蛋白的影响. 世界华人消化杂志 2003; 11(5): 565-568
Effects of allitridi on lymphocyte apoptosis and its regulatory gene expression in rat ulcerative colitis
Xi-Ming Xu, Jie-Ping Yu, Xiao-Fei He, Jun-Hua Li, Min Zheng, Liang-Liang Yu
Xi-Ming Xu, Jie-Ping Yu, Jun-Hua Li, Liang-Liang Yu, Department of Gastroenterology, Renmin Hospital, Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
Xiao-Fei He, Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital of Xianning Medical College, Xianning 437100, Hubei Province, China
Min Zheng, The Center for Laboratory Medicine, Xianning Medical College, Xianning 437100, Hubei Province, China
Supported by: the Educational Foundation of Hubei Province, No. 2002A04006.
Correspondence to: Dr.Xiao-Fei He, Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital of Xianning Medical College, Xianning 437100, Hubei Province, China. doctorhe120@hotmail.com
Received: October 9, 2002
Revised: October 20, 2002
Accepted: October 22, 2002
Published online: May 15, 2003

AIM

To investigate the effects of Allitridi on lymphocyte apoptosis and its regulatory gene expression in rat ulcerative colitis.

METHODS

Rat colitis model was induced by 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS). The apoptotic cells were visualized by TUNEL. Bcl-2 and Bax protein expression in colon tissue was examined by immunohistochemistry. Biochemistry was used to detect the nitrogen monoxide (NO) activity in the mucosa, At the same time, the macroscopical and histological changes of the colon were evaluated.

RESULTS

In TNBS group, the content of nitrogen monoxide, the positive cell quantity of expression of Bcl-2 and the apoptotic cell quantity were higher than those in both normal group and TNBS+Alt group (P<0.01), but Bax positive cell quantity was lower than that in normal group (P<0.01).

CONCLUSION

Allitridi has protective effects on ulcerative colitis of rat by promoting apoptosis of lymphocytes in lamina propria and cleaning NO free radical.

Key Words: N/A
0 引言

溃疡性结肠炎(UC)为肠道的慢性非特异性炎症性疾病, 其发病与感染、遗传、免疫异常等相关[1-8]. 细胞凋亡参与了UC的发病[9-14], 其中, 肠上皮细胞的凋亡加速和炎性细胞的凋亡减慢是UC炎症持续的主要因素. 炎性细胞中淋巴细胞的凋亡减慢和UC的发生关系密切[16-18]. 大蒜素(Alt)具有抗炎、抗真菌、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学活性. 有可能对UC大鼠肠黏膜有一定的保护作用, 我们观察大蒜素对大鼠UC肠组织中淋巴细胞凋亡及其调控蛋白的影响, 探讨大蒜素对UC肠黏膜的保护作用及其可能的机制.

1 材料和方法
1.1 材料

SPF级健康成年SD大鼠48只, 雌雄各半, 质量 150-200 g, 由湖北省医学科学院实验动物中心提供. 2、4、6-三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma); 大蒜素, 湖北五三制药厂生产, Bcl-2和Bax单抗(即用型), 武汉博士德公司; 细胞凋亡检测试剂盒和SP试剂盒为北京中山公司产品; NO检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品.

1.2 方法

将48只动物随机分为空白对照组(Normal group)、三硝基苯磺酸组(TNBS group)、三硝基苯磺酸+生理盐水组(TNBS+NS group)、三硝基苯磺酸+大蒜素组(Alt group)4组. 所有用药组大鼠术前禁食24 h, 自由饮水.造模时用乙醚麻醉大鼠后, 用一直径2.0 mm, 长约12 cm的硅胶管由肛门轻缓插入深约8 cm, 三硝基苯磺酸组以含150 mg/kg TNBS的500 mL/L乙醇溶液0.85 mL缓缓推入大鼠结肠, 诱导UC形成[19]. 三硝基苯磺酸+生理盐水组大鼠以及三硝基苯磺酸+大蒜素组大鼠在灌肠2 d开始每天分别以4 mL的生理盐水和30 mg/kg的大蒜素对其进行灌胃, 1次/d, 至3 wk后处死动物, 取肛门至盲肠段结肠(约8 cm), 沿肠系膜纵轴剪开, 冷生理盐水冲洗干净, 肉眼进行大体形态评分. 肠组织一部分以40 g/L的多聚甲醛固定, 石蜡包埋, 4 μm连续切片, HE染色镜下评价炎症和溃疡, 另一部分-20 ℃冻存, 用以NO检测(采用酶标法测定, 具体操作按照试剂盒说明书进行). 大体形态损伤评分指标包括粘连、局部充血、溃疡及炎症.粘连及充血按有无及轻重分别计0、1、2分, 出现炎症、溃疡数目增加1个、溃疡面积＞2 cm时范围每增加1 cm计分均加1.组织学指标包括溃疡、炎症、肉芽肿、纤维化及病变深度, 按有无及轻重分别计0、1、2分, 病变深度达黏膜下层、肌层、浆膜层分别计1、2、3分, 各项相加得总分.

1.2.1 TUNEl染色 切片脱蜡入水→蛋白酶K(20 mg/L)消化15 min→新鲜配制10 mL/L H2O2/甲醇溶液封闭内源性过氧化物酶(POD)5 min→加UNEl反应混合液含TdT酶和带地高辛的标记液, 37 ℃湿盒孵育1 h→PBS(pH = 7.2)漂洗, 3 min×3次→加POD转换液37 ℃ 30 min→PBS漂洗3min×3次→二氨基联苯胺染色(DAB)显色→苏木素复染→光镜观察. 上述步骤中不加TdT酶作为阴性对照, 并同时取另一张切片作HE染色以定位判断. 光镜下正常淋巴细胞核呈蓝色, 凋亡细胞核为深浅不一的棕褐色(图1).

图1
图1 淋巴细胞中Bcl-2的表达(TNBS+Alt组, ×200).

1.2.2 肠组织淋巴细胞Bcl-2和Bax表达 采用免疫组织化学SP法, 取石蜡切片(4μm)常规二甲苯脱蜡, 下行梯度酒精水化, 置0.05 moL/L柠檬酸缓冲液中进行微波抗原修复, 凉至室温; 30 mL/L H2O2孵育10 min以消除内源性过氧化物酶活性, 滴加100 mL/L正常血清封闭非特异性抗原; 倾去血清, 滴加Bcl-2和Bax抗体(即用型), 4 ℃放置过夜, PBS冲洗3×5 min, 滴加生物素化二抗, 37 ℃孵育10 min, PBS冲洗3×5 min; 滴加辣根过氧化物酶标记的卵白素工作液, 37 ℃孵育15 min; DAB显色, 苏木素复染, 中性树脂封片. 阳性对照为已知的Bcl-2和Bax蛋白, 以PBS代替一抗作阴性对照. 每张切片随机选取5个高倍视野, 计数1000个细胞, 计算阳性细胞百分比; 以16D目镜测微网(面积为0.1 024 mm2)在400倍放大下计数阳性细胞数.

统计学处理 所有实验数据用均数±标准差(x±s)表示, 采用单因素方差分析处理, 以P<0.01为有统计学意义.

2 结果

各用药组大鼠在灌肠后24 h有腹泻, 黏液水便或血性腹泻现象出现. 3 wk后, 三硝基苯磺酸组和三硝基苯磺酸+生理盐水组大鼠结肠肉眼观可见近端肠腔扩张, 结肠组织与周围粘连, 黏膜水肿、溃疡, 有少量点状和片状出血. 光镜下, 可见溃疡和炎性渗出物, 炎症累及肠壁全层, 腺体排列不齐, 杯状细胞减少甚至消失. 固有层有大量中性粒细胞浸润. 可见数量不等的单核细胞和嗜酸性粒细胞, 也可见增生的纤维母细胞, 损伤指数比空白对照组和三硝基苯磺酸+大蒜素组显著增高(P<0.01, 表1). 三硝基苯磺酸+大蒜素组大鼠结肠肉眼观黏膜水肿较轻, 溃疡和炎性渗出物较少见, 光镜下结肠结构基本正常, 黏膜上皮为单层柱状上皮, 由杯状细胞组成, 固有层中腺体呈管状, 可见少量淋巴细胞和中性粒细胞, 黏膜肌层、黏膜下层结构清晰, 损伤指数显著降低, 对照组无腹泻, 黏膜光滑、腺体排列整齐、结构清晰.

表1 各组中组织损伤评分及肠组织中NO浓度(μmol/g)改变的比较(x±s).
分组大体形态组织学NO(μmol/g)
Normal 组1.4±0.51.6±0.7189±18
TNBS 组5.8±0.7b6.1±0.6b523±40b
TNBS+NS 组5.6±0.5 b5.5±0.9 b518±42b
TNBS+Alt 组1.6±0.5df2.1±0.6df197±11df
bP<0.01, vs Normal
dP<0.01, vs TNBS
fP<0.01, vs TNBS+NS.
2.1 一氧化氮含量

在三硝基苯磺酸组大鼠肠组织中, 一氧化氮含量较空白对照组显著增高(P<0.01). 而三硝基苯磺酸+大蒜素组大鼠肠组织中, 一氧化氮含量较三硝基苯磺酸组明显下降(P<0.01, 表1). 三硝基苯磺酸组与三硝基苯磺酸+生理盐水组相比, 大鼠肠组织中一氧化氮含量无明显改变.

2.2 Bcl-2和Bax表达

阳性细胞表现为胞质呈棕褐色(图1, 图2). 正常大鼠肠黏膜固有层中Bcl-2表达阳性淋巴细胞较少(9.8±1.4%), 在三硝基苯磺酸组大鼠肠黏膜固有层中, Bcl-2表达阳性淋巴细胞数(31.0±6.0%)明显增加(P<0.01). 而三硝基苯磺酸+大蒜素组大鼠肠黏膜固有层中, Bcl-2表达阳性淋巴细胞数(10.1±2.5%)较三硝基苯磺酸组大鼠明显减少(P<0.01). 空白对照组大鼠肠黏膜固有层中较多见Bax表达阳性淋巴细胞(30.1±9.7%). 三硝基苯磺酸组大鼠肠黏膜固有层中则较少见(P<0.01). 和三硝基苯磺酸组相比, 三硝基苯磺酸+大蒜素组大鼠肠黏膜固有层中, Bax表达阳性淋巴细胞数未见明显改变(表2).

表2 各组中Bcl-2、Bax、TUNEL阳性细胞数比较(x±s).
Bcl-2阳性细胞数%Bax阳性细胞数%TUNEL阳性细胞数%
Normal 组9.8±1.430.1±9.71.8±0.7
TNBS 组31.0±6.0b9.9±4.8b5.9±2.0b
TNBS+NS 组32.4±7.7b9.6±4.6b6.4±1.3b
TNBS+Alt 组10.0±2.5df13.1±2.52.1±1.0df
bP<0.01, vs Normal
dP<0.01, vs TNBS
fP<0.01, vs TNBS+NS.
图2
图2 淋巴细胞中Bcl-2的表达(TNBS组, ×400).
2.3 TUNEL表达

正常大肠组织仅可见表皮有阳性表达. 三硝基苯磺酸组大鼠肠黏膜固有层中可见少量淋巴细胞和其他炎性细胞有阳性表达. 在三硝基苯磺酸+大蒜素组大鼠肠黏膜固有层中, TUNEL染色阳性淋巴细胞数量较三硝基苯磺酸组大鼠明显增加(P<0.01, 表2, 图3, 图4).

图3
图3 淋巴细胞中TUNEL阳性表达(TNBS+Alt组, ×400).
图4
图4 淋巴细胞中TUNEL阳性表达(TNBS组, ×400).
3 讨论

细胞凋亡(Apoptosis)是细胞接受刺激信号后一种主动的, 由凋亡相关基因控制的细胞程序性死亡方式. 细胞凋亡与UC的关系近年来已经成为UC研究的又一热点[15-18,20-22]. Bcl-2蛋白是一个公认的细胞凋亡抑制基因, Bax是Bcl-2的同源蛋白, Bcl-2/Bax的比率可以调节细胞凋亡的速率[18]. UC中肠道局部炎性损伤是其重要病理改变, 大量炎性细胞浸润肠壁和持续活化是其主要特征. 在UC中, 淋巴细胞的凋亡与UC的发生、发展关系密切, 肠黏膜固有层淋巴细胞的凋亡延迟是UC肠黏膜炎症持续和进展的主要原因之一[11,15]. 淋巴细胞中Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表达强弱可以调节淋巴细胞的凋亡, 从而使UC肠黏膜炎症好转或加重. UC肠组织中淋巴细胞的凋亡延迟, Bcl-2阳性细胞的表达增多, Bax阳性细胞的表达则较少见[10], 本实验也证实了这一结果. 而且本实验中TNBS+Alt组淋巴细胞的凋亡增多, Bcl-2表达阳性淋巴细胞数减少, Bax阳性细胞数未见明显改变. 说明大蒜素可以通过减少Bcl-2蛋白的表达加快肠黏膜固有层淋巴细胞的凋亡, 而对UC有预防和治疗作用.

NO是一种广泛存在与机体的生物活性物质, 参与机体的炎症反应. NO是调节胃肠道血流、胃肠道分泌和胃肠道运动的一种重要化学物质. 大量的资料证实, NO在UC的发病中有重要作用[23-31]. 一氧化氮对UC肠黏膜的作用是双重的, 在UC早期, NO通过增加靶细胞内5-环磷酸鸟苷(5-cGMP)浓度及抑制P-选择素基因表达, 维持微循环的完整性, 抑制血小板、白细胞在内皮细胞表面的黏附, 积聚, 防止血栓形成和内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞的相互作用, 而对肠黏膜起保护作用. 另一方面, 在UC中晚期, 随着NO产生增多和积聚, 他很容易在O-存在时转变为氧化亚硝酸, 进一步分解为OH-和NO, 通过自由基链式反应导致含巯基蛋白和脂质过氧化, 从而促进肠黏膜的细胞损伤. 另外, NO还可以调节多种细胞因子的表达, 促进细胞凋亡的发生. UC病变黏膜中NO浓度的增加与炎症程度呈平行关系, 说明NO参与UC的病理生理过程. 本实验的研究结果也证实了这一点, 和三硝基苯磺酸组大鼠相比, 三硝基苯磺酸+大蒜素组大鼠肠组织中NO浓度明显下降, 说明减少肠组织中NO的生成也是大蒜素对UC肠黏膜起保护作用的机制之一.

本实验通过在建立大鼠UC模型的同时用大蒜素灌胃进行保护, 结果三硝基苯磺酸+大蒜素组大鼠肠黏膜的大体形态和组织学损伤评分指数明显低于单纯三硝基苯磺酸组, 表明大蒜素对大鼠UC有防治作用. 实验结果同时表明大蒜素治疗组大鼠肠组织中NO浓度下降, 并且淋巴细胞的凋亡增加. 提示大蒜素对大鼠UC的治疗作用可能与其清除NO自由基、诱导淋巴细胞凋亡有关.

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