食管癌 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-05-15; 11(5): 522-525
在线出版日期: 2003-05-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i5.522
胃癌SMAD4/DPC4杂合性丢失的研究
朱亚青, 尹浩然, 朱正纲, 刘炳亚, 张奕, 陈雪华, 于颖彦, 林言箴
朱亚青, 尹浩然, 朱正纲, 刘炳亚, 张奕, 陈雪华, 于颖彦, 林言箴, 上海第二医科大学附属瑞金医院外科上海消化外科研究所上海市 200025
朱亚青, 男, 1971-08-27生, 江苏省如皋市人, 汉族. 1994年南京医科大学本科毕业, 2000年上海第二医科大学在读博士研究生, 主治医师. 主要从事胃肠道肿瘤的基础和临床研究.
通讯作者: 尹浩然, 200025, 上海市瑞金二路197号, 上海第二医科大学附属瑞金医院外科, 上海消化外科研究所. yqzhu@hotmail.com
电话: 021-64370045
收稿日期: 2002-08-24
修回日期: 2002-09-15
接受日期: 2002-10-18
在线出版日期: 2003-05-15

目的

探讨胃癌中SMAD4/DPC4杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH)与胃癌临床病理的关系.

方法

用多聚酶链反应－单链构相多态性(PCR-SSCP)银染法分析50例原发性胃癌SMAD4/DPC4的杂合性丢失.

结果

D18S46 LOH为36.2％ (17/47), D18S474 LOH为39.1％(18/46), DPC4 LOH为59.2％ (29/49). SMAD4/DPC4 LOH的发生率随着胃壁浸润深度的加深而增高, 随着TNM分期的增加而增高(P<0.05). 胃癌直径≥5 cm时, SMAD4/DPC4 LOH要明显高于胃癌＜5 cm时(P<0.05). SMAD4/DPC4 LOH在Borrmann分型中有显著性差异(P<0.05).

结论

SMAD4/DPC4的杂合性丢失可能在胃癌的发展中起重要作用, 是胃癌发展后期的重要分子事件.

关键词: N/A
引文著录: 朱亚青, 尹浩然, 朱正纲, 刘炳亚, 张奕, 陈雪华, 于颖彦, 林言箴. 胃癌SMAD4/DPC4杂合性丢失的研究. 世界华人消化杂志 2003; 11(5): 522-525
Loss of heterozygosity of SMAD4/DPC4 in gastric carcinoma
Ya-Qing Zhu, Hao-Ran Yin, Zheng-Gang Zhu, Bing-Ya Liu, Yi Zhang, Xue-Hua Chen, Ying-Yan Yu, Yan-Zhen Lin
Ya-Qing Zhu, Hao-Ran Yin, Zheng-Gang Zhu, Bing-Ya Liu, Yi Zhang, Xue-Hua Chen, Ying-Yan Yu, Yan-Zhen Lin, Department of Surgery, Shanghai Institute of Digestive Surgery, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China
Correspondence to: Hao-Ran Yin, Department of Surgery, Shanghai Institute of Digestive Surgery, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China. yqzhu@hotmail.com
Received: August 24, 2002
Revised: September 15, 2002
Accepted: October 18, 2002
Published online: May 15, 2003

AIM

To investigate the role of loss of heterozygosity (LOH) of SMAD4/DPC4 and the relationship between the LOH and other clinicopathological factors in gastric carcinoma.

METHODS

Total 50 cases of gastric carcinoma were monitored with PCR-SSCP and silver staining was performed to detect LOH of SMAD4/DPC4.

RESULTS

The incidence of LOH was found in 36.2% (17/47) of D18S46, 39.1% (18/46) of D18S474 and 59.2% (29/49) of SMAD4/DPC4, respectively. The prevalence of SMAD4/DPC4 LOH increased progressively from intromucosal to advanced deeply invasive cancers (P<0.05). The frequency of SMAD4/DPC4 LOH was significantly higher in TNM Ⅲ and Ⅳ stage than those in TNM Ⅰand Ⅱ stages (P<0.05). SMAD4/DPC4 LOH was statistically significant association with tumor size (P<0.05). And a strong correlation between SMAD4/DPC4 LOH and Borrmann classification was observed (P<0.05).

CONCLUSION

The SMAD4/DPC4 LOH may promote the progression of gastric carcinoma and is an important molecular event in the development of the tumor at advanced stage.

Key Words: N/A
0 引言

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一, 18号染色体长臂(18q)上遗传物质的丢失在许多肿瘤中是一种常见现象[1-8], 特别在胰腺癌和结肠癌中[9-12], 而其在胃癌中的作用还不明确. 我们分析了胃癌标本中位于18q21位点上的SMAD4/DPC4抑癌基因的杂合性丢失, 并探讨其与胃癌临床病理学之间的关系.

1 材料和方法
1.1 材料

瑞金医院2001-2002年手术切除胃癌标本50例, 男29例, 女21例, 年龄59±14岁; 术前未经任何化放疗(表1). 肿瘤根据UICC规定(Sobin L, Wittekind C. TNM classification of malignant tumors. 5th Ed. 1997: 59-62)分型. 新鲜的肿瘤和正常胃组织手术切除后立即用液氮速冻, 并保存在-80 ℃直至DNA抽提.

表1 18q21LOH与胃癌临床指标的关系.
临床指标n信息个体数LOH(％)
男292817(60.7)
女212112(57.1)
≤40岁442(50.0)
＞40岁464527(60.0)
贲门442(50)
胃体181810(55.6)
幽门282717(63.0)
肿瘤＜5 cm313115(48.4)a
≥5 cm191814(77.8)
高分化111(100)
中分化191910(52.6)
低分化302918(62.1)
Laure分型肠型191910(52.6)
浸润型262514(56.0)
混合型555(100.0)
Borrmann分型隆起型331(33.3)b
溃疡型343319(57.6)
弥漫型888(100.0)
浸润T1551(20.0)c
T2883(37.5)
T3323120(64.5)
T4555(100.0)
淋巴结转移242412(50.0)
无转移262517(68.0)
TNM分期Ⅰ+Ⅱ252511(44.0)d
Ⅲ+Ⅳ252418(75.0)
早期胃癌551(20.0)
进展期胃癌454428(63.6)
aP<0.05 vs ≥5 cm组,
bP<0.05 Borrmann分型组间比较,
cP<0.05浸润深度组间比较,
dP<0.05 vs TNM分期Ⅲ+Ⅳ期.

1.2.1 方法 所有癌组织均经冰冻切片, HE染色. 连续切10 μm厚的冰冻切片10-20张, 对癌细胞比例在70％以下的标本行显微切割. 显微切割参照Lo et al[13]的方法, 稍作修改. 参照相对应的HE染色切片, 在40倍显微镜下用5号无菌注射器将肿瘤细胞与正常组织切割开来, 将其转入1.5 mL的eppendorf管. 用组织裂解液和蛋白酶K消化, 56 ℃孵育过夜. 标准的酚/氯仿/异戊醇法抽提基因组DNA. 用SMAD4/DPC4侧翼的两个紧密连锁的微卫星位点D18S46和D18S474来分析LOH, 其引物序列见表2(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap). 引物由上海博亚生物技术有限公司合成. 50 μL PCR反应体系含10 mmol/L Tris-HCl(pH9.0), 50 mmol/L KCl, 2.5 mmol/L MgCl2, 200 μmol/L dNTP, 1 U TaqDNA聚合酶(Promega公司), 引物各10 pmol. 各反应液中加入150 ng基因组DNA.PCR反应条件如下: 96 ℃预变性10 min, 95 ℃变性30 s, 56-60 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 循环30次, 72 ℃延伸5 min. PCR产物加1:1的加样缓冲液(980 g/L去离子甲酰胺, 25 mg/L二甲苯青, 25 mg/L溴酚蓝, 10 mmol/L EDTA）, 95 ℃变性6 min, 立即置于冰中. 然后加样于100 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳, 80V, 4-5 h. 凝胶经固定(100 ml/L乙醇＋10 ml/L硝酸10 min), 染色(0.012 mol/L硝酸银20-30 min), 显色(0.28 mol/L碳酸钠+19 mg/L甲醛)至带型清晰, 干胶仪(Bio-Rad公司)干燥, 用Flour-STM凝胶成像系统(Bio-Rad公司)扫描, Quantity-one图像分析软件分析图像. 判断标准: 参照Tomlinson et al[14], 当扩增产物为2条分开的主要条带时, 说明此位点为杂合性, 判断为信息个体. 如肿瘤条带中的一条的信号强度与其正常对照组织相应产物比较, 减弱50％以上或消失, 判断为杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH); 与正常对照相比, 如出现异常条带, 则判断为微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI); 当正常对照组织的扩增产物仅为一条时, 称为非信息个体, 不能用来判断LOH.两个位点中至少有一个位点发生LOH, 则判断为SMAD4/DPC4杂合性丢失.

表2 微卫星位点序列.
微卫星位点序列退火温度(℃)
D18S46F 5'-GAATAGCAGGACCTATCAAAGAGC-3'60
R 5'-CAGATTAAGTGAAAACAGCATATGTG-3'
D18S474F 5'-TGGGGTGTTTACCAGCATC-3'56
R 5'-TGGCTTTCAATGTCAGAAGG-3'

统计学处理 应用SPSS(10.0版本)统计学软件对结果进行分析. 计数资料用x2检验, >1/5理论频数<5时, 采用确切概率法, 对等级分组资料用Kruskal-Wallis检验, 以P<0.05有统计学意义.

2 结果

2.1 胃癌DPC4/SMAD4杂合性丢失

胃癌50例中, D18S46位点发生杂合性丢失的频率为36.1％, D18S474为39.1％, SMAD4/DPC4发生杂合性丢失的频率为59.2％(图1, 图2).

图1
图1 D18S46 杂合性丢失非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图. N: 非肿瘤组织; T: 胃癌组织; ←: 杂合性丢失.
图2
图2 D18S474 杂合性丢失非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图. N: 非肿瘤组织; T: 胃癌组织; ←: 杂合性丢失.
2.2 DPC4/SMAD4 LOH与临床病理的关系

随着胃壁浸润深度的加深, SMAD4/DPC4 LOH的发生率从20.0％递升至37.5％, 64.5％和100.0％ (P<0.05); TNMⅠ期和Ⅱ期SMAD4/DPC4 LOH为44.0%, 而TNM Ⅲ期和Ⅳ期则升至75.0% , 两组有显著性差异(P<0.05). 胃癌直径≥5 cm时, SMAD4/DPC4 LOH要明显高于胃癌＜5 cm时(77.8％:88.4％, P<0.05). 在Borrmann分型中, 从隆起型到溃疡型、浸润型, SMAD4/DPC4 LOH也逐渐增高(33.3%:57.6%:100.0%, P<0.05). SMAD4/DPC4 LOH与患者的性别、年龄、肿瘤发生部位、组织学分级、Lauren分型及淋巴结是否发生转移均无统计学意义(P>0.05, 表1).

3 讨论

肿瘤的发生和发展是一多步骤参与的过程, 有癌基因的活化和抑癌基因的失活[15-24]. 根据Knudson"二次打击学说"[25], 许多抑癌基因的失活是在一对等位基因中, 一个突变, 另一个丢失, 或者两个均丢失. 通过杂合性丢失可判断染色体某一位点的一对等位基因有无丢失, 有助于定位及发现抑癌基因. 已有研究报道应用LOH分析胃癌中APC, MCC和DCC的LOH, 发现部分胃癌可能通过LOH病理途径发生[26]. 染色体18q LOH多见于进展期和远处转移的肿瘤, 且预后差[9,11]. 在18q21上存在着多种抑癌基因, 如SMAD4/DPC4, SMAD2和DCC. 胰腺癌中80％可见18q21的丢失, 结直肠癌中60％有18q21的丢失, 约1/3者有SMAD4/DPC4的突变[27]. 晚期和转移性结直肠癌中, SMAD4/DPC4的丢失很常见[11,28,29]. SMAD4/DPC4表达水平与一些恶性肿瘤发生发展、生物学行为及其预后有密切关系, 与阴性表达者比较, 阳性表达者肿瘤多分化好、生长速度慢、侵袭和转移能力弱, 预后较好[30-33]. 我们用与SMAD4紧密连锁的两个微卫星位点D18S46和D18S474分析原发性胃癌, 发现SMAD4/DPC4 LOH为59.2％. Powell et al[34]用与SMAD4邻近的两个微卫星位点分析35例胃腺癌, 发现SMAD4/DPC4 LOH为56％, 与我们的结果很接近. Yustein et al[35]用胃腺癌的异种移植物分析18q21的LOH, D18S474的LOH为58％, D18S46 LOH为53％, 18q 21 LOH为61％, 结果较我们为高, 这可能与他们用的标本是胃癌的移植物, 肿瘤细胞纯度高, 掺杂的正常细胞少有关.

我们结果显示SMAD4/DPC4 LOH与胃癌的胃壁浸润深度有关, 随着浸润深度的加深, LOH从T1 20.0％, T2 37.5％, 增高至T3 64.5％和T4 100.0％. Candusso et al[36]发现在肠型和混合型胃癌中, 18q21 LOH随着胃壁浸润深度的加深而增高. 我们结果还显示SMAD4/DPC4 LOH与胃癌的病理分期有关, TNMⅠ期和Ⅱ期的LOH明显低于TNM Ⅲ期和Ⅳ期(44.0%∶75.0%, P<0.05). 早期胃癌与进展期胃癌比较, 尽管无统计学意义, 但还是可看到他们的差异(20%∶63.6%, P = 0.083), 这可能与我们早期胃癌样本数量少有关. Manzoni et al[37]发现17p和18q21同时存在的杂合性丢失, 多见于Ⅲ期和Ⅳ期的进展期胃癌, 且预后差. Maitra et al[11]分析了结直肠肿瘤, 发现有远处转移的肿瘤, SMAD4/DPC4的丢失和突变明显增高, 而表达却明显降低, 认为DPC4的改变多见于进展期肿瘤. 在Borrmann分型中, 从隆起型到溃疡型、浸润型, SMAD4/DPC4 LOH也逐渐增高(P<0.05). 我们认为SMAD4/DPC4的杂合性丢失是胃癌发展的后期事件, 由于SMAD4/DPC4表达的降低, TGF-β信号通路被破坏, 肿瘤细胞从而逃逸TGF-β介导的细胞生长抑制和凋亡作用, 促进了胃癌的发生和发展.

胃癌多发生50岁以上患者, 少见于40岁以下患者, 发生40岁以下者不足10%. 有研究提示, 青年人胃癌比老年人胃癌更可能有其分子生物学背景[38]. 本组<40岁组占8％, 未发现年龄＞40岁和≤40岁两胃癌组SAMD4/DPC4 LOH检出率有显著差异. 我们研究表明, SMAD4/DPC4与胃癌的TNM分期和胃壁浸润深度有关, 且肿瘤直径＞5 cm的胃癌和浸润型胃癌易发生丢失, 其可能在胃癌的发展中起重要作用.

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