实验性肝纤维化形成过程中几种基质金属蛋白酶表达的研究

摘要

目的

研究基质金属蛋白酶及基质金属蛋白酶抑制因子在大鼠实验性肝纤维化形成过程中的作用及表达.

方法

应用免疫组织化学和核酸原位杂交法研究MMP-1、MMP-2、TIMP-1蛋白及其mRNA和MT1-MMP mRNA在四氯化碳实验性大鼠肝纤维化形成过程中的表达变化.

结果

在肝脏间质细胞和部分肝细胞中表达. 在纤维化形成过程中MMP-1、MMP-2、TIMP-1蛋白及其mRNA和MT1-MMP mRNA的表达程度与肝纤维化程度密切相关.

结论

肝脏间质细胞是MMPS及TIMPS 主要细胞来源, 部分肝细胞也有表达. MMPS及TIMPS在肝纤维化形成过程中共同发挥作用.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: June 27, 2002
Revised: October 15, 2002
Accepted: November 9, 2002
Published online: April 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

目前, 有关肝纤维化时基质代谢的研究不断深入, 特别是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)及其抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)因参与细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的降解, 在肝纤维化发生中的作用受到较大重视[1-18]. 但他们种类繁多, 在肝纤维化发生、发展中的动态变化及其相互关系尚缺乏完整及全面的认识, 我们用免疫组织化学和核酸原位杂交(nucleic acid in situ hybridization, ISH)方法研究几种具有代表性的MMPS及TIMPS在四氯化碳实验性大鼠肝纤维化形成过程中的表达变化, 以期初步探讨肝纤维化形成机制.

1 材料和方法

1.1 材料

Wistar♂大鼠35只, 体重约100 g, 购自北京通利实验动物养殖场.

1.2 方法

(1)建立肝纤维化动物模型: 大鼠随机分为5组, 每组5只, 其余10只为对照组.按照赵景民et al [19] 报道的方法建立四氯化碳(CCL4)毒性肝纤维化模型. 四氯化碳, 橄榄油购自北京中山生物有限公司.首次四氯化碳浓度为750 ml/L, 此后为500 ml/L, 于大鼠皮下注射, 2次/wk, 0.3 mL/100 g, 单周饲普通饲料, 双周饲玉米面. 对照组大鼠饲普通饲料, 不予药物注射. 1-5组分别于2、4、6、8、10 wk停止药物注射, 次日断头处死大鼠, 同时每次处死2只对照组大鼠, 切取部分肝脏, 迅速投入100 ml/L缓冲甲醛固定. (2) 核酸原位杂交: 实验肝组织石蜡切片以漂片法作核酸原位杂交. 生物素标记MMP-1、MMP-2寡核苷酸探针, 购自北京中山生物有限公司. MMP-1cDNA序列: 5'-AAA ACG AAG AGA ATT TTG ACT CTC CAG AAA GCT AAT AGC TGG-3'-Biotin, MMP-2cDNA序列: 5'-GGA GCA TGG CGA TGG ATA CCC CTT TGA CGG TAA GGA CGG ACT CCT-3'-Biotin. MT1-MMP mRNA探针序列参照Okada et al [20] 的cDNA序列, 序列为: 5'-CCT GAT GAC GAT CGC CGT GGC ATC CAG CAA CTT TAT GGA AGC AAG-3'-Biotin, 由赛百盛公司合成寡核苷酸探针. TIMP-1探针序列参照Carmichael et al [21] 的cDNA序列, 序列为: 5'-GAA CAG GGC CCT GAT CAC CAG GTC AGA GTT GCA GAA GGC AGT CTG TGG ATG-3'-Biotin, 由赛百盛公司合成寡核苷酸探针. 用碱性磷酸酶标记的链霉亲合素(Streptavidin, 购自北京中山生物有限公司)作杂交后免疫组织化学染色, NBT/BCIP显色, 在细胞核或细胞质内出现蓝紫色杂交信号为阳性, 未出现特异性染色为阴性. 常规设置阴性对照. (3)免疫组织化学染色: 实验肝组织石蜡切片经常规脱蜡至水洗, 加过氧化物酶阻断液孵育20 min, 1 g/L胰酶37 ℃消化40-50 min. PBS洗涤, 小牛血清白蛋白封闭20 min, 加第一抗体工作液4 ℃过夜, 加第二抗体工作液和第三抗体工作液各孵育40 min左右, 然后加新鲜配制的DAB, 显微镜下观察3-10 min, 阳性信号为棕褐色染色. 以PBS代替第一抗体作为阴性对照. 第一抗体鼠抗人MMP-1、MMP-2, 与大鼠有交叉反应, 购自Dako公司, 工作浓度为1: 10; ABC二抗工作浓度1: 400, ABC三抗工作浓度1: 700. 鼠抗人TIMP-1购自Biovation公司, 与大鼠有交叉反应. 鼠抗人TIMP1抗体工作浓度1: 5, ABC二抗工作浓度1: 300, ABC三抗工作浓度1: 400. 第二抗体均为马抗鼠IgG; 第三抗体链霉亲合素辣根过氧化酶(Strepavdion/HRP)均购自北京中山生物有限公司. (4)常规染色: 常规HE染色, 按2000年全国传染病学术会议修订标准, S代表纤维化程度, 以0-4分期. (5)原位杂交及免疫组化染色结果判定: 常规按阴性(-)、弱阳性(+)、中度阳性(++)、强阳性(+++)纪录.

统计学处理 采用Spearman等级相关分析.

2 结果

2.1 肝脏纤维化程度

结果表明随着药物注射时间的延长, 肝纤维化程度不断加重(表1). 注射药物2、4 wk时肝脏脂肪变性明显, 伴轻-中度肝纤维化, 注射药物10 wk时, 肝脏表现为典型肝硬化, 有的大鼠出现腹水.

表1 实验性大鼠肝纤维化建立情况.

分组	肝纤维化程度
	S0	S1	S2	S3	S4
注射药物2 wk组	1	4	0	0	0
注射药物4 wk组	0	1	4	0	0
注射药物6 wk组	0	0	1	2	2
注射药物8 wk组	0	0	0	2	3
注射药物10 wk组	0	0	0	0	5
对照组	10	0	0	0	0

2.2 在肝脏中的表达

正常肝组织中可见MMP-1及其mRNA、MMP-2及其mRNA、MT1-MMP mRNA、TIMP-1及其mRNA的表达, 但量较小, 仅见于个别间质细胞和肝细胞. 肝纤维化形成过程中他们主要分布于小叶内、中央静脉周围及纤维间隔处, 主要表达于星状、梭形间质细胞, 部分肝细胞亦有表达.

2.3 MMP-1、MMP-1 mRNA、MMP-2、MMP-2 mRNA

在肝纤维化形成过程中的表达(表2)MMP-1、MMP-1 mRNA、MMP-2、MMP-2 mRNA 在肝纤维化形成过程中与正常对照组比较均显著表达(P<0.01), 随着肝纤维化程度增加表达均明显增强(P<0.01).

表2 MMP-1、MMP-2在肝纤维化形成过程中的表达.

分组	n	表达强弱
		-		+		++		+++
		MMP-1	MMP-2	MMP-1	MMP-2	MMP-1	MMP-2	MMP-1	MMP-2
对照	10	6	4	4	6	0	0	0	0
S0-1	6	0	0	5	6	1	0	0	0
S2-3	9	0	0	1	1	5	7	3	1
S4	10	0	0	1	1	3	3	6	6

MMP-1与MMP-1 mRNA, MMP-2与MMP-2 mRNA结果一致.

2.4 MT1-MMP mRNA、TIMP-1和TIMP-1mRNA

在肝纤维化形成过程中的表达(表3)MT1-MMP mRNA 、TIMP-1和TIMP-1mRNA 在肝纤维化形成过程中与正常对照组比较显著表达(P<0.01), 随着肝纤维化程度增加表达明显增强(P<0.01).

表3 MT1-MMP mRNA、TIMP-1在肝纤维化形成过程中的表达.

分组	n	表达强弱
		-		+		++		+++
		MT1-MMP mRNA	TIMP-1	MT1-MMP mRNA	TIMP-1	MT1-MMP mRNA	TIMP-1	MT1-MMP mRNA	TIMP-1
对照	10	4	2	6	8	0	0	0	0
S0-1	6	0	0	5	4	1	2	0	0
S2-3	9	0	0	2	1	6	6	1	2
S4	10	0	0	1	0	2	2	7	8

TIMP-1与TIMP-1 mRNA 结果一致.

3 讨论

大量研究表明肝纤维化发生、发展过程中ECM处在不断代谢更新、降解重塑的动态平衡中, MMPs正是降解ECM的主要酶系, MMPs 是以ECM为主要底物的一组金属依赖性蛋白酶的总称, 目前人体已发现的MMP有17种. MMPs种类繁多, 按照作用底物不同, MMP可分为3类: (1)间质胶原酶(interstitial collagenase)类; (2) Ⅳ型胶原酶; (3)基质酶类; (4)膜型基质金属蛋白酶[1-5,7-11,17,18,22,23].

MMP-1是间质胶原酶的代表酶, 与肝纤维化的发生发展紧密相关[18,24]. 本研究表明在肝纤维化形成过程中, MMP-1 mRNA及其蛋白的表达增强. MMP-1是除中性粒细胞胶原酶外, 唯一特异性分解肝脏Ⅰ、Ⅱ

型胶原的胶原酶, 在肝纤维化时表达增强, 从而降解胶原纤维, 对抗肝纤维化发生, 但总体是合成大于降解, ECM降解虽然加强, 但结果"失代偿".

MMP-2是Ⅳ型胶原酶的代表, 又称明胶酶A, 主要分解Ⅳ型胶原及明胶, 也可分解Ⅵ、Ⅶ、X型胶原. 关于MMP-2在肝纤维化发生、发展中的意义, 目前尚有争议, 但随着肝纤维化的发展, MMP-2 mRNA及其蛋白的表达增强基本形成共识[2,3,7,10], 这与我们的结果一致. 肝窦基底膜的毛细血管化是肝纤维化的病理生理基础, 而窦周出现的Ⅳ型胶原及FN、LN是基底膜的主要成分, 因此特异性的MMP-2在肝纤维化发生发展中起重要意义. 肝纤维化早期, 在致肝纤维化因素作用下, MMP-2可能起到降解破坏正常基底膜作用, 从而为"重塑"基底膜结构打下基础, 随着肝纤维化的发展, Ⅳ型胶原及FN、LN的大量沉积, 基底膜的毛细血管化的形成, 另一方面MMP-2通过反馈调节加强又起到降解沉积Ⅳ型胶原, 维持细胞内环境平衡, 阻止肝纤维化的发展作用, 但总体是基质的合成大于降解, 肝纤维化形成.

MT1-MMP是基质金属蛋白酶基因家族中的一类新组群, 现发现有6个成员[20], 目前报道与肝纤维化有关的主要是MT1-MMP. MT1-MMP结合TIMP, 进而结合MMP-2的羧基端位点, 形成MMP-2/ TIMP-2/ MT1-MMP复合物, 从而激活潜在型MMP-2. 在该实验中, 肝纤维化形成过程中MT1-MMP mRNA表达随肝纤维程度升高而增强与MMP-2表达趋势一致, 充分说明他在肝纤维化发生、发展过程中起重要作用.

TIMP能抑制活性基质金属蛋白酶, 并结合非活性型MMP-2、MMP-9而抑制其活化, 因此间接对细胞外基质的合成及降解起调节作用[2,5,7,10,11].我们实验表明, 在肝纤维化形成发展过程中TIMP-1表达随肝纤维程度升高而增强, 这与其他报道一致[10]. 该结果提示在CCL4损害过程中, 随着肝纤维化的进展, TIMP-1表达持续增强, 通过抑制胶原酶活性, 阻止过量胶原的降解, 从而促进肝纤维化的发生、发展, 这是肝纤维化形成的重要原因.

通过以上分析, 可见MMPS及TIMPS在肝纤维化发生、发展中共同发挥作用, 相互制约、相互协调, 使ECM处于不断合成与降解的代谢过程中, 当肝脏受慢性损害, 他们制约不平衡时则导致ECM合成增多, 肝纤维化形成.

关于MMPs及TIMPS 在肝脏中的细胞来源目前尚未完全阐明.我们观察到在肝纤维化形成过程中主要表达于脂肪变性区域、"纤维细胞间隔"、纤维间隔周围的星状、梭形间质细胞, 推测为活化的肝星形细胞(hepatic stellate cell, HSC)和肌纤维母细胞. 同时我们还发现纤维间隔周围的部分肝细胞也有MMPs及TIMPS 的表达, 而远离损伤区域和纤维间隔的肝细胞则几乎没有MMPs及TIMPS的表达. 推测这些表达MMPs及TIMPS的肝细胞是一部分"特化"的肝细胞, 这部分肝细胞表达MMPs及TIMPS的原因可能是由于正常肝细胞中即存在编码的基因, 平时并不被翻译表达, 只有在肝组织受损, 受到周围环境中的某种"信号"的诱导后, 才表达以参与肝纤维化的形成.由于肝细胞数目巨大, 因此进一步研究这部分"特化"肝细胞的机制有重要意义.

备注

$[Footnotes]

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