中药复方肠安泰对肠癌肺转移模型小鼠肠黏膜固有层B细胞及IL-12的影响

摘要

目的

探讨中药复方肠安泰对肠管绒毛黏膜固有层B细胞及IL-12的影响及其与肺转移的关系.

方法

经皮下植入大肠癌高度肺转移细胞(Co26Lu), 建立大肠癌肺转移小鼠动物模型, 采用ABC免疫染色及免疫荧光染色方法做相关分析.

结果

荷瘤治疗组与荷瘤对照组相比IgA、IgM及IL-12阳性细胞在小肠绒毛黏膜固有层均有显著意义的增加. 两组数值依次为172.3±6.7, 59.2±5.3, 79.6±4.1; 131.2±5.3, 45.1±4.3, 24.4±2.5(P<0.01).

结论

中药复方肠安泰预防大肠癌肺转移的机制, 与其促进了荷瘤小鼠小肠绒毛黏膜固有层B细胞的活化及IL-12的诱导有关.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: November 21, 2002
Revised: December 10, 2002
Accepted: January 18, 2003
Published online: April 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤, 手术是治疗大肠癌的主要手段, 但术后5 a生存率一直徘徊在50-55 %, 50 a来并无显著提高, 成为手术失败的主要原因. 根据中医基础理论[1]本研究提出肿瘤转移"痰毒流注"病机假说[2-4], 研制中药复方肠安泰进行预防大肠癌转移的研究.实验证明中药复方肠安泰预防大肠癌(Co26 Lu)肺转移机制中, T细胞、NK细胞及细胞因子IFNγ发挥着重要的作用[5,6]. 本实验的目的在于探讨中药复方肠安泰对肠管绒毛黏膜固有层B细胞及IL-12的影响及其与肺转移的关系.

1 材料和方法

1.1 材料

♂CDF1系5WK小鼠(购自日本CharlesRiver公司)30只, 体质量23-26 g分笼饲养, 自由饮水, 饲料为繁殖用固性饲料(CLEA日本), 动物室为无菌条件, 控制温度, 12 h明暗周期. 给予1 wk的预备饲养, 待小鼠6 wk时进行实验.中药复方肠安泰为省科委基金课题观察处方, 由藤梨根, 黄芪, 补骨脂, 鸡血藤组成.所有生药均购自辽宁中医学院附属医院, 由辽宁中医学院中药系醇提精制成干膏. 山羊抗小鼠IgA抗体, 工作浓度1: 16, 山羊抗小鼠IgM抗体, 工作浓度1: 128, 购于美国Sigma公司, 大鼠抗小鼠IL-12抗体, 工作浓度2 kg/L, 购于美国PharMingen公司, ABC免疫组化试剂盒购于美国VectorLaboratories.Inc公司. 大肠癌高度肺转移细胞(Co26Lu)由日本国立癌中心飯郷正明惠赠.

1.2 方法

将小鼠随机分成正常对照组、荷瘤对照组及荷瘤治疗组, 每组10只小鼠. 正常对照组为非造模组. 荷瘤对照组为造模组: 将Co26Lu细胞皮下注入小鼠右大腿, 每只0.1 mL, 含1×10⁵个癌细胞.荷瘤治疗组: 从小鼠造模后3 d开始, 每天灌胃予肠安泰0.75 g/Kg, 持续给药18 d. 正常对照组, 荷瘤对照组小鼠于每日相同时间, 用相同方法给予等量生理盐水. 灌胃18 d后24 h, 乙醚麻醉小鼠, 解剖取小肠、大肠, 4 ℃丙酮固定, 标本切除, 石蜡包埋, 制成3 μM切片备用. 小肠、大肠的IL-12细胞均采用ABC免疫组化方法染色, 方法参见试剂盒说明书进行.主要步骤为: 切片按常规脱蜡处理至水, 1 mL/L牛奶浸泡20 min, PBS漂洗5 min, 每片加入一抗20 ml, 室温2 h, PBS漂洗3次各5 min, 在含30 mL/L的H₂O₂的Metoh中浸泡5 min, PBS漂洗3次各5 min, 加入二抗(黄色液3滴, 蓝色液1滴)20 μl, 室温1 h, PBS漂洗15 min, 加入(ABC盒的A液2滴, B液2滴)20 μl, 常温1 h, PBS漂洗3次各5 min, 0.1 g/L的DAB/0.3 mL/L的H₂O₂显色, 流水冲洗10 min, 苏木紫核染色2 sec, 经过脱水, 透澈及封入剂封入. 在高倍光镜下, 随机观察相连10个绒毛, 计数小肠、大肠的绒毛黏膜固有层的IL-12阳性细胞数, IL-12阳性细胞在细胞核上出现棕色颗粒. 免疫荧光染色: 切片按常规脱蜡处理至水, 1 mL/L的牛奶浸泡20 min, PBS漂洗5 min, 加入含有FITC的一次抗体, 室温放置60 min, 用PBS洗3次, 干燥后加盖玻片, 暗处保存.在高倍光镜下, 随机观察相连10个绒毛, 计数小肠、大肠的绒毛黏膜固有层的IL-12阳性细胞及IgA, IgM阳性细胞数, IgA, IgM阳性细胞在细胞核上出现荧光.

统计学处理 数据以均数±标准差(mean±SD)表示, 采用日本医学统计软件, 组间IgA、IgM及IL-12阳性细胞的对比用Dunnett's T检验.

2 结果

2.1 小肠绒毛黏膜固有层B细胞及IL-12(表1)

表1 中药复方肠安泰对肠绒毛黏膜固有层B细胞及IL-12的影响(n =10, mean±SD 阳性细胞数/10个肠绒毛).

分组	IgA	IgM	IL-12
小肠 正常对照组	88.6±3.2	26.7±3.6	18.2±2.1
荷瘤对照组	131.2±5.3a	45.1±4.3a	24.4±2.5
荷瘤治疗组	172.3±6.7a	59.2±5.3a	79.6±4.1a
大肠 正常对照组	42.7±2.6	18.4±1.9	10.5±1.6
荷瘤对照组	50.1±3.2	26.7±2.1	16.1±1.9
荷瘤治疗组	65.4±4.1b	30.0±2.9	25.6±2.1b

^aP<0.01 vs 正常对照组;

^bP<0.05 vs 荷瘤对照组.

小肠绒毛黏膜固有层的IgA、IgM阳性细胞数, 荷瘤对照组与正常对照组相比, 均有显著增高, 有统计学意义(P<0.01). 荷瘤治疗组与荷瘤对照组相比也具有显著性差别(P<0.01); 小肠绒毛黏膜固有层的IL-12阳性细胞数, 荷瘤对照组与正常对照组相比, 有增高趋势, 但无统计学意义.荷瘤治疗组与荷瘤对照组相比具有显著性增高(P<0.01).

2.2 大肠绒毛黏膜固有层B细胞及IL-12(表1)

荷瘤对照组与正常对照组相比, 大肠绒毛黏膜固有层的IgA、IgM及IL-12阳性细胞均有增高趋势, 但无统计学意义.大肠的荷瘤治疗组与荷瘤对照组相比IgM有增高趋势, 但无统计学意义, 而IgA及IL-12组有统计学意义(P<0.05).

3 讨论

肠道黏膜是一个非常复杂的免疫部位或免疫器官, 黏膜淋巴细胞具有归巢性, 口服具有免疫作用的药物可以引起黏膜的免疫反应, 也能引起系统免疫反应, 因此黏膜是宿主防御的第一道防线. 肠道黏膜固有层的淋巴细胞LPL位于上皮层下, 是黏膜免疫系统MIS受作用于黏膜表面的特异抗原物质发展而成, 在预防肿瘤转移中发挥着重要的作用[7-10].

阻止肿瘤转移免疫机制的研究多从T淋巴细胞角度探讨[11-15]. 对体液免疫研究者较少, 有临床研究发现大肠癌患者的免疫球蛋白中的IgG, IgM处于正常水平, 而IgA则明显低于正常值[16]. 本实验显示肿瘤(Co26Lu)发生及肿瘤转移初期, 小肠的肠管绒毛黏膜固有层的IgA及IgM B细胞均有增加趋势, 但这种程度的增加, 仅仅是机体产生的肿瘤免疫反应或是免疫刺激, 并未能达到抑制肿瘤生长及转移的作用. 而中药复方肠安泰显著地、有意义地增加了荷瘤小鼠IgA, IgM B细胞及细胞因子IL-12在小肠绒毛黏膜固有层的分布.表明中药复方肠安泰抗大肠癌肺转移(Co26Lu)的机制与B细胞和细胞因子IL-12在小肠内增加有关, IL-12的抗肿瘤作用特别是其抗转移活性尤其令人注目[17-22]. 许多肿瘤动物实验模型表明, IL-12可在肿瘤的微环境中达到持久的局部浓度, 能抑制肿瘤的生长或使肿瘤完全消退, 阻止恶性转移, 抑制远处肿瘤的生长[23-27]. 更重要的是, IL-12使一些动物显示持久的系统免疫, 对肿瘤的再攻击具有保护作用[28-31]. IL-12通过调节NK细胞、巨噬细胞介导的非特异性免疫和Th细胞、细胞毒性T细胞介导的特异性免疫作用[32].

过去实验表明中药复方肠安泰能够增加T细胞及NK细胞在小肠黏膜固有层的数量[5], 并能通过诱导IFNγ的产生而抑制肿瘤生长和转移[6]. 也就是说中药复方肠安泰一方面在来源于B细胞的IL-12介导下, 产生IFNγ而发挥抗肿瘤转移的作用, 另一方面诱导产生的IL-12的抗肿瘤作用可能是由于CD8+T、NK细胞所介导的. 在整个免疫应答过程中, 小肠黏膜固有层淋巴细胞起主导作用, 大肠黏膜固有层淋巴细胞起辅助作用.

备注

$[Footnotes]

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