肿瘤抑制因子p21/waf1 与肝炎病毒复制与表达的调节研究

摘要

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Correspondence to: N/A

Received: October 29, 2002
Revised: November 10, 2002
Accepted: November 18, 2002
Published online: April 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

作为一种肿瘤抑制基因, p21/waf1在细胞周期、细胞凋亡、信号转导以及癌变中具有十分重要的调节作用[1]. 肝炎病毒, 特别是乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的感染, 不仅引起急性和慢性病毒性肝炎, 而且与肝纤维化、肝细胞癌(HCC)的发生、发展密切相关[2]. 这些肝炎病毒感染靶细胞之后, 在细胞内对于细胞正常的调节机制产生严重干扰, 这是肝炎病毒致病的分子生物学机制的重要组成部分[3]. 其中, 肝炎病毒蛋白对于p21/waf1的异常调节具有十分重要的生物学和医学意义.

1 肝炎病毒蛋白与p21/waf1调节的相关性

肝炎病毒蛋白与p21/waf1调节之间的相关性已经积累了丰富的资料. 目前认为, 细胞周期调节紊乱是HCC发生的重要机制, 但是, 肝炎病毒对于细胞周期调节的影响目前还不清楚. Choi et al[4]对于HCC组织中细胞周期素D1、细胞周期素E、p53、p27、p21/waf1、p16、Rb和增生细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达进行免疫组织化学研究, 表明细胞周期素D1过表达与肿瘤进展到晚期、低度分化、肿瘤大小、微血管浸润、肝脏内转移、缺乏肿瘤包膜形成、浸润性生长、p53表达异常、PCNA表达水平升高等有关. 异常的p53表达与低分化程度有关. 细胞周期素D1或p53表达异常在异常增生中没有见到. 其中p21/waf1的调节异常值得重视. Crary et al[5]应用免疫组织化学研究结果表明, p21/waf1表达与肝细胞Ki-67这种肝细胞增生标志物和组织病理学特征相关. 正常的肝组织和非酒精性脂肪肝炎(NASH)组织中很少表达p21/waf1和Ki-67蛋白, 在酒精性肝炎肝组织中p21/waf1表达水平升高, 但Ki-67表达水平不变. 慢性丙型肝炎肝组织中p21/waf1的表达与Ki-67的表达以及炎症、纤维化程度显著相关. 说明肝脏炎症显著上调p21/waf1的表达, 而且表达水平与疾病严重程度相关. Shi et al[6]也发现HCC组织中出现p53相关的p21/waf1的表达水平改变.

肝炎病毒蛋白对于p21/waf1的影响, 不仅表现在蛋白水平上, 而且在转录水平上也有反应. Han et al[7]对于表达HBxAg的细胞系进行了588个细胞基因的表达谱型基因芯片的分析, 发现2个癌基因(IGFR-2, RhoA)、1个细胞周期调节基因(p55CDC)、3个细胞内信号转导相关基因(凝血酶受体, MLK-3, MacMARCKS), 1个应急应答蛋白基因（HSP27）、2个细胞凋亡应答基因(FAST激酶, Bak), 1个转录因子基因(p21/waf1)表达上调; 而1个转录因子基因(转录延长因子SII), 2个生长因子基因(单核细胞趋化蛋白1, T-淋巴细胞分泌蛋白I-309)显著下调.

关于肝炎病毒蛋白对于p21/waf1表达调节的研究结果也有不同的研究报道. Park et al[8]研究发现HBxAg对肝细胞基因表达具有调节作用, 改变了肝细胞对细胞凋亡刺激信号的敏感性, 对肝细胞的生长阻滞进行异常调节. 对p53基因突变的肝癌细胞系Hep3B进行研究, 稳定或瞬时表达HBxAg的肝癌细胞系p21/waf1的mRNA和蛋白表达水平上升, 与细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)的结合能力提高, 显著抑制细胞周期素E-CDK2相关的组蛋白H1的磷酸化修饰, 增强p21/waf1基因启动子的表达活性. p21/waf1基因启动子序列缺失突变研究结果表明, HBxAg应答元件位于p21/waf1基因启动子序列转录起始位点上游, 即-1 185-1 482 nt之间.启动子序列的突变分析发现HBxAg应答元件与转录因子ETS结合位点相邻. 研究发现HBxAg可以克服p53 的缺失, 对其下游的信号转导系统产生影响, 直接导致p21/waf1基因转录的激活. 提示p21/waf1抑制剂的开发在肝细胞癌的治疗中具有很大潜力, 特别是在p53基因突变, 有HBV感染时尤其如此. Su et al [9]的研究发现黄曲霉毒素B1(AFB1)与HBV感染在p21/waf1表达调节中具有协同作用. 实验中52.9 %的树驹发生HCC, 而单纯感染HBV和单纯摄入AFB1的动物发生HCC分别只有11.1%和15.8%, 对照组没有发现HCC. 肝组织中胰岛素样生长因子-II(IGF-II)的表达率分别为82.4%、22.2%、26.3% 和0, 有显著差异. p21/waf1的表达分别为29.4%、11.1%、15.8% 和0, HBxAg的表达在联合组也高于单纯HBV组(52.9%对11.1%). 这些基因的过表达与HCC发生有关. 表明p21/waf1表达在HBV和AFB1协同诱发HCC中具有重要作用.

2 肝炎病毒蛋白结构及其对p21/waf1调节的影响

肝炎病毒蛋白的结构性质和特点是其调节p21/waf1表达的重要基础. HCV核心蛋白对于p21/waf1基因表达具有直接的抑制作用. Jung et al[10]研究了HCV核心蛋白对p21/waf1启动子活性的抑制作用. HCV核心蛋白N-端部分缺失几乎完全失去p21/waf1启动子活性的抑制作用, 进一步研究表明HCV核心蛋白84-191 aa是其抑制p21/waf1 表达的功能结构域. HCV核心蛋白突变体S99L对p21/waf1基因的抑制作用与野生型基本相同, S116I或S116A突变则导致HCV核心蛋白的抑制作用完全消失. S116D突变体的抑制作用与野生型相似, 表明酸性的天门冬氨酸残基可以模拟磷酸化的效果. 当以蛋白激酶A(PKA)的抑制剂H-89进行处理时, HCV核心蛋白的抑制作用呈现剂量依赖性的降低, 在浓度为5 mmg/L时完全阻断. 相反, 以PKA的激活剂二丁酰-cAMP作用时, HCV核心蛋白的抑制作用显著升高, 表明HCV核心蛋白对p21/waf1的抑制作用是通过PKA对其S116的磷酸化修饰来调节的. Wang et al[11]应用谷胱甘肽S-转移酶（GST）的pull-down分析, 证实HCV核心蛋白与p21/waf1可以形成复合物. 缺失定位分析结果表明, HCV核心蛋白N-末端的(24-52 aa)和p21/waf1的 C-末端的(139-164 aa)是这一复合物形成关键的结构基础. p21/waf1蛋白在147、149、150等这些与PCNA结合相关的位点上发生突变, 并不影响与HCV核心蛋白的结合, 提示p21/waf1蛋白与HCV核心蛋白、PCNA的结合结构基础截然不同. 由于与p21/waf1结合的位点十分接近, HCV核心蛋白与PCNA蛋白之间存在与p21/waf1蛋白结合的竞争性抑制现象.

Suzuki et al[12]研究证实HCV核心蛋白是遍在蛋白-蛋白复合体降解途径作用的靶蛋白. 首先, HCV核心蛋白的C-末端疏水区是代谢不稳定区, 与蛋白体抑制物共同孵育可以显著增加这种蛋白的积聚. 其次, 体内遍在蛋白化分析结果表明, 遍在蛋白的多个链上都有HCV核心蛋白的结合. 相反, 虽然稳定的HCV核心蛋白也可以遍在蛋白化, 但是只有单个或少数的遍在蛋白的结合位点. 因此, HCV核心蛋白C-末端的遍在蛋白化影响HCV核心蛋白的代谢, 以进行调节.

3 肝炎病毒蛋白对p21/WAF1调节的p53蛋白的依赖性

在正常的细胞信号转导过程中, p21/waf1是p53蛋白调节作用下游的一种靶分子. 因此, 肝炎病毒蛋白对于p21/waf1的调节可能会与p53蛋白的调节作用有关. Ahn et al[13]研究了HBxAg蛋白对于p21/waf1的调节作用及其与p53蛋白之间的相互关系. HBxAg是HBV引起HCC的主要因素, 在HBxAg的转基因小鼠模型中得到证实, 主要机制就是对一系列病毒和细胞的启动子序列的反式激活作用. 我们的研究证实表达HBxAg的细胞系的p21/waf1 RNA表达水平降低, 调节机制是对p21/waf1基因转录水平的抑制, 而且是p53依赖性的. 在p21/waf1基因的启动子序列中存在Sp1的结合位点, 因此推测HBxAg通过Sp1对p21/waf1 基因表达进行负调节. 因为肿瘤抑制基因p21/waf1编码产物的表达在多种类型的组织和细胞中都存在, 而且是细胞周期素-CDK 复合物和DNA合成的抑制剂, 诱导细胞在G1-S检验点进入阻滞状态, 因此HBxAg对于p21/waf1的调节在HBV引起的HCC中具有十分重要的地位和作用.

丙型肝炎病毒蛋白对于p21/waf1的调节作用也与p53蛋白密切相关. Ray et al[14]应用NIH3T3、HepG2、HeLa 细胞系的体外瞬时表达系统分别证实HCV核心蛋白对于p21/waf1基因启动子的表达具有显著的抑制作用. p21/waf1基因启动子序列缺失突变分析表明HCV核心蛋白应答区位于p53结合位点. 凝胶迟滞分析表明HCV核心蛋白与p21/waf1基因启动子序列没有直接结合的功能. 因此, 认为HCV核心蛋白促进细胞增生的作用, 是通过未知细胞蛋白因子对p21/waf1转录激活抑制而实现的. Otsuka et al[15]对于 HCV各种蛋白对p53基因表达活性的影响进行了研究, 发现只有核心蛋白提高p53 和p21/waf1的表达水平, 而后者是p53主要的作用靶蛋白. 以电泳泳动度迁移率分析(EMSA)法证实HCV核心蛋白不仅提高p53蛋白的DNA结合功能, 而且以启动子的报告基因技术证实核心蛋白对于p53基因的转录水平也有显著的增强作用. 在GST融合蛋白分析结果中发现, HCV核心蛋白C-末端可以与p53直接结合, 另外HCV核心蛋白与Htaf(II) 28这种转录因子复合体的成分进行结合, 这些结果表明HCV核心蛋白与p53可以结合, 而且对于p53依赖性启动子的转录活性具有显著的调节作用. Lu et al [16]研究证实HCV核心蛋白可以提高p53基因的转录水平, 不管这种p53基因是内源性的还是外源性的. HCV核心蛋白对于p53基因的这种调节作用, 也得到HCV核心蛋白可以提高p53作用下游靶基因p21/waf1表达水平的佐证. HCV核心蛋白通过对p53的调节来显著抑制肝癌细胞系的生长. 体外免疫共沉淀技术、GST pull-down技术、Far-Western blot分析技术等证实HCV核心蛋白和p53可以结合, 缺失作图分析证实p53蛋白C-末端部分(366-380 aa)是其与核心蛋白结合的位点. 研究结果提示HCV核心蛋白可能通过直接的物理结合激活p53. HCV核心蛋白对p53蛋白的持续激活是慢性HCV感染致病机制的重要组成部分.

Kwun et al[17]研究, 证实NS3蛋白对于p21/waf1的基因表达具有特异性的、剂量依赖性的抑制作用. 这种抑制作用是细胞类型非依赖性的, 而且与HCV核心蛋白具有协同作用. 当p21/waf1启动子序列中p53结合位点被缺失以后, NS3蛋白对于p21/waf1启动子的抑制作用则完全消失, 提示NS3蛋白对于p21/waf1启动子活性的抑制作用是p53依赖性的. 另外, NS3蛋白对于具有p53结合位点的其他启动子也具有抑制作用. 尽管NS3对于p21/waf1调节的功能域位于蛋白酶结构位点, 但是蛋白酶活性并不是其抑制作用所必须的. NS3蛋白对于p53的基因转录和蛋白的稳定性都没有显著的影响, 因此推测NS3对于p21/waf1基因启动子序列的调节是通过NS3蛋白-p53蛋白之间的相互作用实现的. 表达NS3蛋白的NIH 3T3细胞系生长速度至少是母本细胞生长速度的2倍. 说明NS3蛋白对于p21/waf1蛋白的抑制作用可以促进细胞的增生. HCV NS5A蛋白是一种磷酸化的蛋白, 与哺乳动物细胞中数种蛋白具有结合作用, 为了研究这种结合的生物学意义, Arima et al [18]建立了5种四环素控制表达HCV NS5A蛋白的小鼠、人细胞系, 表达NS5A的这些细胞系均表现出生长迟滞现象, 细胞周期分析结果表明, 表达NS5A的人上皮细胞S的细胞比例下降, G2/M期细胞比例上升, 可由p53依赖性的p2/waf1蛋白和mRNA表达水平的降低来解释. HCV NS5A 在体内和体外都能与CDK1结合, 在表达NS5A蛋白的细胞系中, 相当数量的p21/waf1与CDK2结合成复合物形式. CDK1和细胞周期素B1蛋白表达水平也有相应下降, 与G2/M期细胞比例上升一致, 这些研究结果表明, NS5A造成的细胞生长抑制和细胞周期调节异常, 主要是通过对CDK1/2-细胞周期素复合物的调节实现的. HCV NS5A蛋白促进细胞生长, 在转录水平上影响p53信号转导系统下游分子p21/waf1启动子表达活性, Majumder et al[19]对于NS5A介导的p21/waf1基因转录水平抑制的机制进行了研究. 通过应用p53 野生型(+/+)纯合子缺失突变型(-/-)细胞系的研究, 发现NS5A蛋白对p21/waf1基因转录的抑制是p53依赖性的, 不仅如此, HCV NS5A蛋白对于含有多个p53结合位点的人工合成的启动子指导的报告基因表达载体(PG13-LUC)的表达活性也具有显著的抑制作用. 以pull-down 技术、体外免疫共沉淀技术和哺乳动物细胞双杂交技术证实NS5A 与p53蛋白之间存在物理性结合. 共聚焦显微镜技术发现p53 与NS5A蛋白在HepG2和Saos-2细胞中结合, 共同存在. 因此, 认为NS5A和 p53之间的相互作用, 是NS5A蛋白对于p21/waf1基因表达活性进行调节, 进而引起HCC的重要机制之一.

Ghosh et al [20]应用酵母双杂交技术证实NS5A与新型转录因子蛋白SRCAP C-末端序列结合, 这种结合也得到了哺乳动物细胞双杂交技术、体外pull-down技术以及体外免疫共沉淀技术等的证实. 体外瞬时转染证实SRCAP可有效激活转录. SRCAP 增强NS5A蛋白的对p21/waf1启动子的转录抑制作用增强. NS5A 和SRCAP的调节作用可能是HCV感染致病机制的重要组成部分.

备注

$[Footnotes]

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