丙型肝炎病毒与MAPK信号转导系统

摘要

N/A

关键词: N/A

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Correspondence to: N/A

Received: October 29, 2002
Revised: November 10, 2002
Accepted: November 18, 2002
Published online: April 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)是一种正链RNA病毒, 其致病机制与DNA病毒和逆转录病毒有明显的区别[1]. 在病毒的生活周期中, HCV基因组编码多种结构和非结构蛋白, 自身结合形成同二聚体形式, 或与其他HCV病毒蛋白、细胞蛋白结合形成异二聚体, 甚至是多聚体形式在肝细胞内存在[2]. 另外, 不同的磷酸化形式, 还可以发生细胞内转位, 对细胞的功能与调节产生影响. 在肝细胞质、细胞核中的HCV蛋白对肝细胞正常的信号转导通路进行干扰, 这是HCV致病机制的重要组成部分[3]. 丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ ERK)及其介导的细胞内信号转导是HCV蛋白作用的重要靶位, 了解HCV蛋白对MAPK信号转导通路的影响, 对于HCV慢性感染的形成, 甚至是HCV相关的肝细胞癌(HCC)的发生机制的研究具有重要意义[4].

1 HCV的包膜蛋白与MAPK信号转导

关于HCV受体的研究目前还没有定论, HCV受体究竟是单一受体, 还是象人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)那样具有主要受体和辅助受体目前尚不清楚[5]. 目前的研究焦点是CD81低密度脂蛋白受体(LDL-R)等.在四跨膜分子CD81、 CD81分子在人肝细胞等细胞膜的表面表达, 这种蛋白与细胞内信号转导过程有关. 最近的研究结果表明人细胞膜上CD81的表达与HCV包膜糖蛋白E2及其进入肝细胞中的过程有关[6]. 因此, CD81分子作为HCV感染肝细胞的受体分子而得到广泛的关注. HCV E2-CD81分子之间的相互作用与HCV感染及其致病机制密切相关, MAPK/ERK与细胞的增生和组织的增生过程密切相关. 为了研究HCV对于MAPK/ERK的调节, Zhao et al[7]应用人肝癌细胞系HepG2进行了研究. CD81在HepG2 细胞膜表面有一定水平的表达, 通过流式细胞学的免疫荧光技术的检测得到了证实. HepG2细胞以不含胎牛血清(FCS)的DMEM培养基培养, 7 h后, 以HCV E2蛋白处理不同的时间. 细胞内MAPK/ERK的状态以Western blot杂交、免疫组织化学和免疫荧光技术进行研究. HepG2细胞中MAPK/ERK蛋白在受到HCV E2蛋白的刺激以后发生磷酸化修饰, 而且MAPK/ERK的磷酸化与作用的HCV E2蛋白的浓度有关, 是一种剂量和时间依赖性的效应. MAPK/ERK在HepG2受到HCV E2蛋白的刺激后被激活, 表明HCV E2-CD81作用参与了细胞内信号转导, 可能在HCV感染的致病过程中发挥重要作用.

2 HCV核心蛋白与MAPK信号转导

为了研究HCV的恶性转化作用, Tsuchihara et al[8]建立了稳定表达HCV核心蛋白的BALB/3T3 A31-I-1细胞系, 这一细胞系在受到HCV 核心蛋白与v-H-ras的基因共转染时, 就失去生长接触抑制, 发生形态学改变, 呈现非贴壁生长, 而且出现非血清依赖性生长的特点. 表达HCV核心蛋白的细胞系在受到生长因子的刺激以后, 生长速度显著加快.另外, 以人工合成的反义寡聚脱氧核糖核苷酸(ODN)阻断细胞中HCV核心基因的表达, 对于其生长具有一定的抑制作用. HCV核心蛋白可激活MAPK和血清应答元件(SRE).

HCV的基因分型和HCV核心蛋白的一级结构序列对于其功能也具有十分重要的意义. Giambartolomei et al[9]研究证实HCV基因型1 a和3的核心蛋白对于MEK1和Erk1/2 MAPK都有激活作用, HCV核心蛋白持续表达可产生Raf1和MAPKK高基础水平的表达, 这种现象可以通过内源性Raf1活性的体外分析及高度磷酸化的Erk1和Erk2的水平检测而得到证实, 甚至在血清饥饿状态下也存在这种现象. Erk1/2及其下游转录因子Elk-1的激活的时间在细胞受到EGF的刺激以后显著延长. 尽管存在MAP磷酸酶MKP的反馈调节, 表达HCV核心蛋白的细胞在受到EGF的刺激后这种激活仍然存在, 可能与Raf-1的持续激活有关. HCV核心蛋白对于MAPK激酶链具有直接的激活作用, 这也是HCV核心蛋白对细胞具有转化作用的机制之一. Erhardt et al[10]建立了四环素控制的表达全长(191 aa)或部分序列(160 aa)的HepG2 细胞系. 发现HCV核心蛋白可以激活细胞外信号调节激酶(ERK)、c-jun N-末端激酶(JNK)、p38 丝裂原激活蛋白(MAP)激酶、诱导MAP激酶磷酸酶MKP-1的表达, 并促进细胞的增生. 同时伴有c-Jun和ATF-2的激活, 但没有Elk-1和c-Fos的激活. 另外, AP-1的激活过程与c-Fos的状态无关. 全长或截短型HCV核心蛋白具有相似的作用.

HCV核心蛋白对于细胞凋亡具有促进和抑制的双向调节作用, 主要决定于诱导细胞的刺激因素和当时细胞所处的状态有关. Takamatsu et al[11]研究了HCV核心蛋白对血清饥饿诱导的细胞凋亡的影响进行了研究. 稳定表达HCV核心蛋白的NIH 3T3细胞系对于血清饥饿诱导的细胞凋亡具有一定的抑制作用.但p53、p21Waf1和Bax 在血清饥饿诱导后都有诱导性表达, 与HCV核心蛋白是否表达无关. 表明这种情况下的细胞凋亡是p53非依赖性的. 不表达HCV核心蛋白的细胞系, 细胞受到血清饥饿后诱导的细胞凋亡可由p38/MAPK的特异性抑制剂SB203 580部分逆转, 但在表达HCV核心蛋白的细胞系中没有阻断作用. 血清饥饿激活的p38 MAPK, 在表达HCV核心蛋白的细胞系中, 其磷酸化形式的蛋白水平有显著下降. 表明HCV核心蛋白对于血清饥饿诱导的细胞凋亡具有抑制作用, 而且这种抑制作用是p38 MAPK激活依赖性的.

MAPK信号转导系统在细胞的增生、恶性转化和应急应答的调节中具有重要作用. HCV核心蛋白具有潜在的致瘤作用, 但机制目前不十分清楚. MAPK细胞外信号调节激酶(ERK)的激酶(MEK)-ERK信号转导途径以及其下游的靶基因, 即血清应答元件(SRE), 在BALB/3T3表达HCV核心蛋白时被激活. 为了阐明HCV核心蛋白激活MEK-ERK途径的机制, Fukuda et al[12]以HCV核心蛋白瞬时转染几种不同的细胞系, 并应用Gal4-Elk1萤虫素酶报告基因表达载体、体外MAPK的Western blotting杂交分析对其信号转导途径进行了研究. 发现存在有丝分裂原的刺激时, HCV核心蛋白可增强MEK下游的Elk1的激活, 而对ERK活性及Elk1的磷酸化没有影响. 研究结果表明HCV核心蛋白可通过经典的磷酸化修饰链激活Elk1. 说明HCV感染是引起肝细胞发生恶性转化的可能机制之一.

HCV感染与HCC有关, 而HCC的发生与MAPK/ERK信号转导途径有关, 因此Hayashi et al[13]研究了HCV核心蛋白对于MAPK/ERK级联反应的影响. HCV核心蛋白可显著激活MAPK/ERK的级联反应, 包括Elk1. HCV核心蛋白单独情况下就可以激活MAPK/ERK. 有趣的是, Elk-1的活性在受到促癌因子12-O-十四酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)的作用下进一步升高, 但表达HCV核心蛋白的NIH 3T3 和HepG2细胞受到EGF和TGFα的刺激后, 没有进一步的升高. HCV核心蛋白对MAPK/ERK的激活作用, 当被MEK1特异性抑制剂PD98 059阻断. 这些研究结果表明, HCV核心蛋白激活ERK是肝细胞有丝分裂原介导的信号非依赖性的, 但与TPA有协同作用. HCV核心蛋白可能存在对MEK1的调节作用, 或者对更为上游的信号转导环节产生影响.

在针对病原体的早期免疫应答过程中有补体成分的参与, 补体成分在清除病原体感染宿主血清中的抗原的过程中具有十分重要的作用. Yao et al[14]研究表明HCV核心蛋白在HCV感染的初期首先表达, 并且在HCV感染宿主的血液循环中存在, 通过与补体受体的结合, 即C1q受体球状位点(gC1qR)的结合, 抑制T细胞的增生反应. 为了研究HCV核心蛋白与C1qR相互作用及其对T细胞增生的抑制作用及机制, 研究了HCV核心蛋白对于T细胞激活早期事件的影响. 发现HCV核心蛋白抑制ERK和丝裂原激活ERK激酶(MEK)蛋白的磷酸化. HCV核心蛋白对于ERK/MEK MAPK的干扰, 造成了白介素-2(IL-2)和白介素-2受体α(IL-2Rα)基因转录水平的下降, 最终造成IL-2的产生以及高亲和力IL-2R的表达水平的下降. 抗-gC1qR抗体可以逆转HCV核心蛋白对ERK/MEK 磷酸化水平的影响, 说明HCV核心蛋白和gC1qR与ERK/MEK MAPK的激活有关. 表明HCV核心蛋白可通过补体依赖性的调节途径阻断T细胞激活的细胞内事件, 在HCV慢性感染的形成过程中发挥重要作用.

3 HCV非结构蛋白NS3与MAPK信号转导

慢性丙型肝炎发病机制中氧化应急产生的活性氧(ROS)发挥一定的作用. 吞噬细胞及激活的巨噬细胞释放的ROS是主要氧化应急产物的来源. 但是HCV蛋白作用于单个核细胞后产生活性氧的情况目前还不十分清楚. Bureau et al[15]对于HCV刺激的单个核细胞产生活性氧的情况进行了研究. 健康正常人的外周血单个核细胞PBMC受到HCV的核心蛋白、NS3、NS4、NS5蛋白刺激以后, 以化学发光技术对于产生的ROS进行了测定. 发现只有NS3蛋白可以触发PBMC产生ROS, 主要包括阴性氧离子. PBMC受到NS3刺激以后, 出现快速而短暂的细胞内钙水平的升高. 应用不同的代谢抑制剂, 证实ROS的产生需要钙离子的流入, 以及酪氨酸激酶以及应急激活蛋白激酶p38的参与.发现p47 (PHOX)发生磷酸化和细胞内转位, 表明在这一过程中有NADPH氧化酶的参与. NS3对于佛波12-肉豆蔻酸-13乙酸盐(PMA)诱导的氧化爆发(oxidative burst)具有抑制作用. 研究结果表明HCV NS3蛋白可激活NADPH氧化酶, 调节ROS的产生, 在HCV感染的发病机制中具有一定作用.

4 HCV非结构蛋白NS5A与MAPK信号转导

丙型肝炎病毒NS5A蛋白对于PKR具有抑制作用. PKR所介导的IFNα抗病毒作用部分地通过抑制eIF2α的磷酸化, 进而抑制mRNA翻译而实现的. He et al[16]研究了HCV NS5A蛋白对PKR mRNA翻译过程的抑制作用. 痘苗病毒载体VV E3L表达的蛋白是一种很强的抑制因子. 以IFNα预处理表达缺陷型基因的VVDeltaE3L HeLa S3细胞, PKR和eIF2α的磷酸化水平都显著升高.当表达NS5A蛋白VVNS5A的细胞系受到IFNα刺激时, PKR 和eIF2α的磷酸化水平出现瞬时下降. 表达VVDeltaE3L的细胞系受到IFNα的刺激以后, p38 MAPK活性升高, 符合其位于PKR信号转导的下游的事实. 另外观察到这些细胞中eIF4E的磷酸化水平升高, 这是p38下游的信号转导环节.在VVNS5A感染的细胞系中这些调节作用都有不同程度的下降. NS5A还具有抑制表达NS5A蛋白受到表皮生长因子(EGF)激活时的p38-eIF4E磷酸化. NS5A诱导的eIF2α和eIF4E磷酸化可能在调节mRNA翻译过程中有矛盾. 事实上表达VVNS5A的细胞系受到IFNα的刺激以后, 只是部分短暂地回复VVDeltaE3L细胞与病毒的mRNA翻译过程. 综上所述, NS5A作为一种PKR的抑制物, 在总体上具有维持HCV感染早期mRNA翻译水平的功能, 而感染晚期更使HCV mRNA适合帽状结构非依赖性的翻译过程.

在细胞内, HCV NS5A蛋白可在细胞丝氨酸/苏氨酸激酶的催化作用下发生磷酸化. 为了确定NS5A蛋白在细胞内磷酸化的位点, Reed et al [17]以同位素标记HCV-H NS5A的磷酸化多肽, 进行纯化, 对于磷酸化氨基酸残基位点进行分析, 并通过Edman降解法证实. 发现HCV-H NS5A蛋白磷酸化的位点是Ser(2321). 这一磷酸化位点的确定, 得到了另外2种方法研究结果的证实. 如对Ser(2321)突变为Ala, 磷酸化蛋白修饰立即消失, 对合成多肽片段的磷酸化修饰研究结果进行分析, 证实NS5A蛋白的磷酸化修饰位点为Ser(2321). 对NS5A的Ser(2321)位点进行定点诱变, 表明NS5A蛋白的磷酸化修饰是NS4A和PKR结合非依赖性的. NS5A蛋白富含脯氨酸的位点恰好位于Ser(2321)的周围, 如PLPPPRS(2321) PPVPPPR, 表明细胞内脯氨酸特异性激酶是HCV NS5A磷酸化的激酶类型, 这与以前以蛋白激酶抑制剂研究的结果是一致的.

NS5A蛋白分子结构中存在几个富含脯氨酸(proline-rich)的序列结构, 与SH3结合位点结构一致, 提示在信号转导的调节过程中具有十分重要的作用. NS5A可以与Grb2接头蛋白(adaptor protein)结合. Tan et al [18]以抗-Grb2抗体的免疫印迹分析结果表明, 从表达HCV NS5A蛋白的HeLa S3细胞来源的免疫复合物, 发现了NS5Ae可与Grb2结合. Grb2蛋白N-末端SH3结构域的突变明显影响与NS5A蛋白之间的结合, 但C-末端的SH3位点的基因突变则影响不大. Grb2分子中2个位点同时突变则造成Grb2与NS5A蛋白之间的结合完全消失, 说明Grb2蛋白分子中的这2个SH3结构域在与NS5A蛋白的结合过程中具有协同作用. NS5A的突变分析结果表明, 富含脯氨酸的SH3结合区在所有基因型的HCV病毒株都是保守的[19,20]. NS5A蛋白在细胞内的表达抑制HeLa S3细胞中ERK1/2的磷酸化. 稳定表达NS5A蛋白的HeLa细胞在受到EGF的刺激后ERK1/2不发生磷酸化. 在这些细胞受到EGF的刺激后发生NS5A与Grb2蛋白之间的结合. 因此, NS5A可能是通过与选择性接头蛋白的结合干扰Grb2介导的信号转导.

备注

$[Footnotes]

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