0 引言
抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术. 其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA消减杂交技术. 通过合成两个不同的接头, 连接于测试cDNA 片段的5'末端, 达到选择性扩增差异性表达的cDNA片段, 抑制非目的cDNA的扩增. 该技术与其他消减杂交技术相比具有假阳性率低、敏感性高、效率高等优点而得到广泛应用.
1 抑制性消减杂交技术产生的背景
高等真核生物细胞中约含有4-10万个不同的基因, 但在生物体的发育过程中只有15%的基因得以表达. 这些基因的选择性表达决定了生物体的各项生命活动: 个体的发育和分化、体内稳态的维持、细胞周期的调控、衰老、细胞凋亡等. 因此要了解人体各项生命活动的调控机制, 就必须将这些差异表达的基因分离、鉴定并作深入研究, 为此人们建立了一系列研究基因表达差异的方法.
cDNA消减杂交技术是一类较早建立的技术[1], 其原理是将要比较基因表达差异的双方cDNA进行杂交, 通过羟基磷灰石层析、亲和素-生物素结合等方法, 从杂交混合物中分离、鉴定出未杂交的部分. 应用这些方法曾分离、鉴定出一些重要基因, 例如T细胞受体(TCR)等, 但不能有效获得低丰度的转录物, 需多步的杂交层析过程. 1992年Liang et al[2,3]建立了mRNA差异显示法(mRNA differential display)或称差异显示逆转录PCR(differential display reverse ranscription PCR, DD-RT-PCR), 其特点是原理简单、灵敏度高, 但是假阳性率高达70%. 1993年Lisitsyn et al[4,5]在进一步完善DD-RT-PCR基础上发展了代表性差异分析法(representational difference analysis, RDA), 该技术充分发挥了PCR以指数扩增双链模板, 而以线性扩增单链模板的特性, 通过消减和富集, 使得目的基因片段得到特异性扩增, 但仍需多次杂交、PCR步骤, 较为繁琐. 1994年Hubank et al[6]将RDA技术改良, 设计了cDNA-RDA方法, 该方法用于比较具有相近遗传背景、表型不同的两组cDNA之间的差异, 但如果两组cDNA之间存在较大差异, 以及某些基因在检测子中存在上调表达时, 此方法显得力不从心, 很难达到预期的目的. 1996年Diachenko et al[7,8]在RDA的基础上发展了抑制性消减杂交技术, 他克服了DD-RT-PCR法的假阳性较高和RDA法消减杂交轮次较多的缺点, 适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因及其功能.
2 抑制性消减杂交方法的原理
抑制性消减杂交技术是一种以抑制性PCR反应为基础, 将标准化测试cDNA单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术. 通过合成两个不同的接头, 接于经限制性内切酶消化后的测试cDNA片段的5'末端, 将测试和驱动进行两轮杂交. 标准化步骤均等了测试中的cDNA单链丰度, 消减杂交步骤去除测试和驱动之间的共同序列. 利用抑制性PCR选择性扩增目的cDNA片段, 同时抑制非目的cDNA的扩增. 因此, 抑制性消减杂交技术显著增加了获得低丰度差异表达的cDNA的概率. 所谓抑制性PCR是利用链内退火优于链间退火, 使非目的序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生"锅柄样"结构, 无法与引物配对, 从而选择性抑制非目的序列片段扩增[9]. 抑制性消减杂交技术的基本实验过程如下. 首先, 将要进行比较的两种组织或细胞来源的mRNA样品反转录为cDNA, 把含有目的基因的cDNA称为测试(tester), 把参考cDNA称为驱动(driver), 用同一种限制性内切酶Rsa I切割, 产生末端平头的片段, 将测试cDNA分为两份, 每份连接不同的接头, 即: 接头1(adaptor 1)和接头2(adaptor 2). 接头为双链DNA片段, 且5'-端均无磷酸基, 这样保证只有接头中的长链可以与cDNA的5'-末端连接, 两个接头含有可识别的序列. 接下来进行两次杂交. 第一次杂交在每个测试里加入过量驱动, 然后变性、退火, 根据杂交动力学第二定律, 即丰度越高的分子退火速度越快, 因此测试cDNA与驱动cDNA相同片段大都形成异源双链分子, 使得差异表达的单链分子得到富集. 第二次杂交, 将进行过首次杂交的两组样品不经变性而直接混合, 只有剩下的经过消减并平均化了的差异表达的单链cDNA可以重新结合为新的杂交体分子, 这种杂交体分子两端带有不同的接头1和接头2, 加入新鲜变性的驱动进行第二轮消减杂交, 进一步富集差异表达的杂交体分子, 并用DNA酶补平末端, 这样差异表达的测试序列-杂交体分子5'-和3'-端就有了进行巢式PCR所需的不同的退火位点. 最后, 进行两次PCR反应, 第一次PCR只有两端连接有不同接头的双链cDNA片段才得以指数扩增, 而其他形式如一端有接头, 而另一端无接头的只能线性扩增, 没有引物结合点的不能扩增, 还有两端为同一接头的形成袢状而无法获得指数扩增. 利用巢式引物进行第二次PCR, 富集差异表达的基因片段. PCR产物可以被直接插入T载体, 或者利用接头1上的NotI/SmaI/XmaI位点和接头2R上的EagI位点进行定向克隆, 或者接头与cDNA连接处的RsaI位点平端克隆. 然后利用测序和杂交分析来分析差异表达的序列, 或者用PCR产物作探针来筛选DNA文库.
3 抑制性消减杂交技术的优点
在分离、克隆差异表达的基因序列片段中, 抑制性消减杂交技术具有独特的优点. 虽然基因芯片技术在差异表达基因谱分析中也非常有用, 但是, 所进行筛选的基因片断的种类是人为限制的. 因为基因芯片制备过程中基因的种类和数量就已经决定了检测结果的范围. 但是抑制性消减杂交技术的研究目的和可能得到的结果则不受预先设置条件的限制. 换句话说, 抑制性消减杂交技术更适合差异表达的新基因的克隆化. 此外还有以下一些特点: (1)在分离稀少基因方面具有优势: cDNA消减杂交、代表性差异分析、mRNA差异显示方法都不能分离到低丰度的差异表达基因. 而抑制消减杂交技术对高、低丰度的差异表达基因都能有效分离. 这一重要优点主要归功于均等(normalization)过程, 实验证明经过一轮消减可对稀少转录物富集达1000-5000倍[10]. (2)效率高: 一次SSH反应可同时分离到几十到几百个差异表达的基因. (3)简便易行: 抑制性消减杂交技术所采用的方法简单、成熟、易掌握、易操作. (4)假阳性率低: 采用两次消减杂交和两次PCR, 保证该方法有较高特异性. 具有关报道证明抑制性消减杂交方法假阳性率可降至6%. (5)筛选周期短: 应用这种方法一般3-4 d即可获得差异表达基因片段的cDNA.
4 抑制性消减杂交技术的应用
抑制性消减杂交技术自1996年报道以来, 该技术已被多名研究者采用, 并与其他分子生物学技术相结合, 克隆了多种新基因.
在慢性肝炎、肝纤维化和肝细胞癌的发生发展中基因调控的研究应用. 乙型肝炎、丙型肝炎慢性化机制目前尚不清楚, HBV、HCV进入肝细胞后, 病毒基因组表达的反式激活蛋白对肝细胞基因组具有反式调节作用[11,12], 从而影响肝细胞生长调节, 可能是HBV、HCV感染慢性化及发生恶性转化的重要分子生物学机制之一. 刘妍et al[13]在研究乙型肝炎X蛋白(HBxAg)反式激活作用时, 应用SSH方法构建了HBxAg反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库, 随机挑选65个克隆测序分析, 结果主要包括2种类型, 第一种是已知基因的序列, 与GenBank中数据高度同源(96-100%), 其中包括一些已知的看家基因序列和一些与细胞生长调节密切相关的基因序列, 如真核翻译启动因子、核糖体蛋白编码基因, 与细胞的转录、翻译功能密切相关; 乙肝病毒X基因, 与转染的HBx基因的表达有关; 胶质母细胞瘤放大的分泌蛋白, 肿瘤抑制因子ST13, Bcl-2结合蛋白Nip3, 可能与肝细胞凋亡及恶性转化密切相关; S100钙结合蛋白, 鸟嘌呤核苷酸蛋白(G-蛋白)与细胞周期生长调节及信号转导途径密切相关. 第二种是未知基因序列, 共获得15个差异表达的未知序列, 其功能有待进一步研究. 同时应用抑制性消减杂交技术构建HCV核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库[14], 经测序分析后, 所得克隆包括6个未知序列, 56已知的看家基因及与细胞生长调节密切相关的基因如WEE1. 这些研究结果对阐明乙、丙型肝炎慢性化及HBV、HCV致肝细胞癌发生之间的关系具有重要的理论意义. Nagayama et al[15]在研究自身免疫性肝炎(AIH)发病机制的过程中, 利用SSH技术, 发现AIH肝细胞干扰素诱导蛋白10 (interferon inducible protein 10, IP10) mRNA表达较正常肝细胞明显增强, 同时运用免疫组化方法证明IP-10在AIH肝细胞中过量表达, 且运用逆转录PCR分析63例不同类型肝炎组织标本, AIH中IP-10表达明显高于其他类型肝炎, 因此作者认为IP-10表达升高是AIH的标志, IP-10在AIH的发病机制中起重要作用. 在肝纤维化研究方面, Cassiman et al[16]利用SSH技术比较正常鼠HSC与D-半乳糖胺诱发肝炎鼠的HSC mRNA表达差异, 结果发现αB-晶体蛋白(alpha B-crystallin, ABCRYS)表达上调. 实验证实, 在人和鼠HSC体外细胞培养中加入gal内毒素后也发现ABCRYS mRNA表达升高, 作者认为, ABCRYS可能是HSC激活后的早期标志, 有利于HSC存活, 对其研究将有利于了解肝纤维化发展的机制.
抑制性消减杂交技术在肿瘤相关基因克隆化中也有重要的应用前景. 在肿瘤相关基因的研究中, Miyasaka et al[17]利用SSH技术研究丙型肝炎相关肝癌及癌旁组织基因表达不同, 发现了一些过度表达的基因, 7个已知基因包括灶性粘连激酶(focal adhesion kinase, FAK)、结肠癌缺失基因(deleted in colon cancer)、鸟嘌呤结合阻止蛋白α(guanine binding inhibitory protein α)、M130、胃蛋白酶原C(pepsinogen C)、谷氨酰胺合成酶(glutamine sythetase)、鸟氨酸转氨酶(omithine aminotransferase)以及2个未知基因(HCC-1和HCC-2). 其中灶性粘连激酶磷酸化激活后能阻止凋亡, 胃蛋白酶原C的表达在前列腺癌中受雄激素水平的调节[18], 而HCC是以男性为主的疾病[19], 胃蛋白酶原C和灶性粘连激酶在HCC发生中的作用尚不明确, 但HCC中二者过度表达可能为研究HCC发病机制提供新的方向. Piter et al[20]用SSH获得肾细胞癌组织与非转化肾组织差异表达基因, 共获得9个在肾细胞癌中差异表达的cDNA, 序列分析表明7个与已知基因同源, 2个为新基因, 克隆的7个已知基因中的5个与肿瘤的恶性表型有关. Wang et al[21]用SSH技术在食管癌中鉴定出一个命名为EC45基因, 其在70 %食管癌中过度表达, 且与核糖体蛋白L15的开放读码框架有100%同源性. 说明SSH对肿瘤组织是一种高灵敏度的有效的鉴别差异表达序列的方法.
在器官发育方面, Diachenko et al[7]用SSH技术建立了一个睾丸特异性cDNA文库, 用消减的cDNA混合物作为一个杂交探针来鉴定人Y染色体基因库的同源性, 进一步证实了这个人类DNA是以睾丸特异性方式而表达. 在免疫学方面, Roh et al[22]在研究破骨细胞分化过程中基因的调控作用时, 将SSH技术与cDNA微陈列技术相结合, 建立了破骨细胞与巨噬细胞、破骨细胞与树突状细胞mRNA差异性表达文库, 以及TRANCE诱导造血干细胞分化为破骨细胞过程中mRNA差异性表达文库, 提供了研究破骨细胞分化基因调节及骨肿瘤相关基因的新方法. Li et al[23]用SSH方法检测了人类特异性过敏源性Th2细胞中差异表达基因, 分析并鉴定出72个序列, 这种差异性Th2基因文库可能阐明Th2细胞功能和变态反应性疾病的遗传学基础. Wang et al[24]在寻找脑局部缺血耐受的相关基因中, 用SSH方法筛选出差异表达基因基质金属蛋白酶-1抑制剂编码基因, 提示其在局部缺血耐受中发挥潜在作用.
高等真核生物的所有生命现象, 例如细胞生长、器官形成、恶性转化都是基因选择性表达的结果, 要弄清这些生命现象的分子调节机制, 就要对选择性表达的基因进行分离、克隆、序列分析, 然后研究其氨基酸组成, 表达产物结构、功能等. 抑制性消减杂交技术为寻找表达基因和研究已知基因的新生物学功能提供了一个有利工具. 并且由于抑制性消减杂交技术可用于比较不同细胞、不同组织的基因表达差异, 因此必将在生物发育、细胞调控、肿瘤、衰老及组织损伤的研究中得到越来越广泛的应用.
