修回日期: 2002-11-15
接受日期: 2002-11-28
在线出版日期: 2003-04-15
应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活的相关基因cDNA消减文库, 克隆HCVNS3反式激活相关基因.
以HCVNS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞, 以空载体pcDNA3.1(-)为对照; 制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA, 经RsaI酶切后, 将实验组cDNA分成两组, 分别与两种不同的接头衔接, 再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR, 将产物与T/A载体连接, 构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌进行文库扩增, 随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.
文库扩增后得到70个白色克隆, 经菌落PCR分析, 得到56个200-1000bp插入片段.对所得片段测序, 并进行同源性分析, 获得6个差异表达的未知序列, 可能是NS3反式激活的新的靶基因.
成功构建HCVNS3反式激活的相关基因cDNA消减文库, 为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础.
引文著录: 牟劲松, 刘妍, 王刚, 成军, 段惠娟, 李克, 陆荫英, 王琳, 王惠芬. 应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因. 世界华人消化杂志 2003; 11(4): 399-403
Revised: November 15, 2002
Accepted: November 28, 2002
Published online: April 15, 2003
To construct a subtractive cDNA library of genes transactivated by NS3 protein of hepatitis C virus (HCV) with suppressive and subtractive hybridization technique and clone genes associated with transactivation.
The mRNA was isolated from HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-)-NS3, and pcDNA3.1(-) empty vector, respectively; cDNA was synthesized. After digestion with restriction enzyme RsaI, cDNA fragments were obtained by restriction enzyme RsaI digestion. Tester cDNA was then divided into two groups and ligated to the specific adaptor 1 and adaptor 2, respectively. After tester cDNA was hybridized with driver cDNA twice and underwent two times of nested PCR, amplified cDNA fragments were subcloned into T/A plasmid vectors to set up the subtractive library. Amplification of the library was carried out with E. coli strain JM109. The cDNA was sequenced and analyzed in GenBank with Blast search after PCR.
The amplified library contained 70 positive clones. Results of PCR study indicated that 56 clones had inserts of 200-1 000 bp in length. Sequence analysis suggested that six novel cDNA sequences might be target genes transactivated by NS3 protein.
The subtractive library of genes transactivated by NS3 protein of HCV was constructed successfully.
- Citation: Mu JS, Liu Y, Wang G, Cheng J, Duan HJ, Li K, Lu YY, Wang L, Wang HF. Cloning of genes transactivated by NS3 protein of HCV with suppressive and subtractive hybridization. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2003; 11(4): 399-403
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v11/i4/399.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v11.i4.399
目前, 丙型肝炎病毒(HCV)与肝细胞之间相互作用的分子生物学机制尚不完全清楚, 其中, 病毒编码的蛋白能够影响多种细胞信号转导途径, 从而进一步影响肝细胞某些基因的表达、调控, 可能是病毒感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生、发展的重要原因[1-10].
HCVNS3在病毒多蛋白前体加工并转化为成熟蛋白的过程中, 发挥了重要作用, 非结构蛋白(NS)区各蛋白的产生依赖于此蛋白对病毒多蛋白前体的酶解和修饰[11-18]. 本实验应用抑制性消减杂交(suppressionsubtractivehybridization, SSH)技术[19-24], 构建HCVNS3反式激活的相关基因差异表达的cDNA消减文库, 通过对所得片段进行序列同源性分析, 筛选相关的靶基因, 为研究丙型肝炎病毒致病机制提供理论依据.
HepG2细胞及感受态大肠杆菌JM109(本室保存), pcDNA3.1(-)真核表达载体(Invitrogen), LipofectaminePLUS转染试剂(Gibco), mRNA纯化试剂盒(amershampharmaciabiotech), PCR-SelectcDNASubtraction试剂盒(Clontech), 50×PCREnzymeMix、AdvantagePCRCloning试剂盒(Clontech), HighPurePCRProduct纯化试剂盒(BoehringerMannheim), T7、SP6通用引物及pGEM-Teasy载体(Promega). HCVNS3真核表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3由本室构建.
(1)细胞转染及细胞mRNA提取用LipofectaminePLUS转染试剂将2μgpcDNA3.1(-)-NS3及pcDNA3.1(-)空载体分别转染35mm平皿HepG2细胞, 48h后收获细胞. 使用mRNA纯化试剂盒, 直接提取转染了重组表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA, 经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计进行定性、定量分析. (2)双链cDNA(dscDNA)合成使用PCR-SelectcDNASubtractionKit, 以获得的mRNA为模板逆转录合成cDNA. (3)消减杂交文库的建立采用PCR-SelectcDNASubtractionKit, 常规SSH方法按说明书进行: 转染了重组表达质粒及空载体的HepG2细胞cDNA分别标记为Tester和Driver, 经RsaⅠ消化, 产生相对较短的平端片段, 纯化酶切产物. 将Tester的cDNA分为两份, 分别连接试剂盒提供的特殊设计的寡核苷酸接头Adapter1和Adapter2, 然后与过量的DrivercDNA进行杂交; 合并两种杂交产物后再与DrivercDNA作第2次杂交; 然后将杂交产物做选择性PCR扩增, 使TestercDNA中特异性表达或高表达的片段得到特异性扩增. (4)克隆鉴定分析扩增产物与pGEM-Teasy载体连接, 转化JM109感受态细菌, 在含氨苄青霉素的LB/X-gal/IPTG培养板上, 37 ℃培养18 h. 挑取白色菌落, 增菌, 以pGEM-Teasy载体多克隆位点两端T7/SP6引物进行菌落PCR扩增, 产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定, 证明含有插入片段(200-1000bp)后, 测序(上海博亚公司). 应用生物信息学将测得序列与GenBank数据库进行同源性分析.
使用高质量的mRNA是保证cDNA高产量的前提. 紫外分光检测显示, 转染了真核表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA分别为4.54 μg和4.23 μg, A260/A280 = 1.7, 10 g/L琼脂糖凝胶电泳见mRNA为>0.5 kb清晰慧尾片状条带, 证实mRNA质优量足.
dscDNA与接头连接效率的高低是决定抑制性消减杂交成败的最关键步骤.将连接有adaptorl和adaptor2的两组dscDNA分别用不同的特异性引物(看家基因甘油三磷酸脱氢酶G3PDH引物)进行28个循环扩增, 产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.结果显示两组dscDNA扩增产物浓度相当, 说明dscDNA已与接头高效率连接.
分别以消减及未消减PCR产物为模板, 用G3PDH引物进行PCR扩增, 分别在18、23、28、33次循环结束时从体系中吸取5 mL进行电泳鉴定. 结果显示: 与未消减组PCR产物相比, 消减组PCR产物中G3PDH基因产物大大减少, 说明所构建的消减文库具有很高的消减效率(图1).
杂交产物经两轮PCR扩增后, 凝胶电泳显示部分差异表达的cDNA条带, 这些条带可能代表差异表达的基因片段.对差异表达基因片段进行菌落PCR扩增, 结果显示为200-1000 bp大小不等的插入片段, 所获得的70个克隆中有56个含有插入片段(图2).
对56个克隆测序, 与GenBank数据库进行初步比较. 其中6个克隆未检索到任何对应的相似序列, 可能代表了某些新基因. 其余50个均与已知基因的部分序列高度同源(92-100%)(表1).
| 已知的同源序列编码蛋白 | 相同克隆数 | 同源性(%) |
| HCV NS3编码蛋白 | 6 | 100 |
| 核糖体蛋白 | 6 | 100 |
| 线粒体蛋白 | 2 | 100 |
| 血清白蛋白 | 1 | 99 |
| 角蛋白18 | 1 | 99 |
| 硫氧还蛋白 | 1 | 99 |
| 亮氨酸富集重复蛋白 | 1 | 96 |
| 乳酸脱氢酶A | 1 | 100 |
| 磷脂酶A2 | 1 | 100 |
| 酪氨酸磷酸酶 | 2 | 93 |
| 醛酮还原酶C1 | 3 | 100 |
| 异柠檬酸脱氢酶1 | 1 | 100 |
| S-腺苷高半胱氨酸水解酶1 | 2 | 99 |
| RNA聚合酶I | 1 | 100 |
| RNA解旋酶 | 2 | 100 |
| T细胞分化蛋白 | 2 | 100 |
| 丝裂素诱导蛋白 | 1 | 92 |
| 单核细胞向巨噬细胞分化相关蛋白 | 1 | 100 |
| 细胞周期进展蛋白3 | 1 | 98 |
| 转录延伸因子A(SII)/转录 | 1 | 100 |
| 因子样蛋白MRGX | ||
| 真核翻译延伸因子 | 1 | 100 |
| DEAD/H盒蛋白多肽1 | 1 | 99 |
| GDA1/CD39家族 | 1 | 99 |
| TAR(HIV)RNA结合蛋白1 | 1 | 99 |
| 肿瘤生长因子-β超家族蛋白 | 2 | 99 |
| 白介素1受体 | 1 | 100 |
| 干扰素相关发生调节因子 | 1 | 97 |
| 染色体序列 | 5 | 100 |
| 新基因序列 | 2 | |
| 无法分析序列 | 4 | |
| 克隆总计 | 56 |
HCV基因组含有单一的开放读码框架, 编码3010-3033个氨基酸残基的多肽前体, 两侧是5'-非翻译区及3'-非翻译区, 多肽前体至少被加工为十种结构蛋白和非结构蛋白. 其中非结构蛋白NS3共有631个氨基酸组成, 具有丝氨酸蛋白酶、三磷酸核苷酶(NTPase)和解旋酶(Helicase)的功能, 在HCV多聚蛋白的成熟和病毒复制过程中发挥重要作用[25-28], 同时, NS3内部的裂解产物还具有致癌作用, 如裂解c-raf癌基因产物N末端使之激活, 启动肿瘤形成[29-40].
近年的研究发现, NS3是蛋白激酶Ａ(PKA)和蛋白激酶Ｃ(PKC)介导的磷酸化作用的有效调节因子, 从而影响环磷酸腺苷(cAMP)及磷脂酰肌醇(PI)等信号转导通路中蛋白激酶的级联反应, 进而调节基因转录、激活特定基因表达. NS3调节PKA和PKC磷酸化作用活性, 是通过作为底物调节因子这种类似于分子伴侣的作用方式进行的[1]. 另据报道, Kato etal[2]通过对多种信号转导通路中共同出现的可诱导的增强子进行检测发现, NS3可激活血清应答元件(SRE)、激活蛋白1(AP-1)、血清应答因子(SRF)等增强子相关信号转导途径, 其中, SRE、AP-1可调节、增强细胞的增生. 由此可见, HCV非结构蛋白NS3的反式激活功能在HCV致病中发挥了重要作用, 那么, 细胞内NS3的表达, 究竟影响、激活了哪些特定基因的表达？这些表达产物对细胞的损害、增生分化的作用如何？
基于上述研究目的, 我们采用抑制性消减杂交方法, 克隆HCVNS3基因转染细胞反式激活差异表达的基因, 构建其cDNA消减文库, 为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础. SSH是近年发展起来的一项基因克隆技术, 可以对两份mRNA样品进行比较, 并获得只存在于其中一份样品而不存在于另一份样品的基因克隆, 通过SSH构建的cDNA消减文库具有以下三个优点: (1)高度特异性, 经过两轮消减杂交和两步抑制性PCR, 极大提高了文库的特异性. (2)高敏感性, SSH技术使高、低丰度特异表达的基因均得到有效地分离扩增. (3)高效率, 在一次SSH反应中可以同时分离几十甚至成百个差异表达的基因[41-52].
我们应用SSH方法成功地构建了HCVNS3反式激活的相关基因差异表达的cDNA消减文库, 并进行测序分析, 结果主要包括2种类型, 第一种是已知基因的序列, 与GenBank中数据高度同源, 其中包括一些已知的看家基因序列和一些与细胞生长调节密切相关的基因序列, 如转录延伸因子A(SII)/转录因子样蛋白MRGX、真核翻译延伸因子、核糖体蛋白基因等, 与细胞的转录、翻译功能密切相关; HCVNS3编码蛋白基因, 与转染的NS3基因的表达有关: 酪氨酸磷酸酶基因, 与肝脏发育、肝细胞再生、癌变有关[53-63]: 肿瘤生长因子-b超家族蛋白、T细胞分化蛋白基因与T细胞免疫应答相关[28-30]. 第二种是未知序列, 共获得6个差异表达的未知序列, 可能代表了某些新基因, 进一步的分析和功能鉴定正在进行中.
在实验中, 克隆到了一些理论上似乎没有差异表达的基因, 这可能与SSH技术本身的一些特点有关.实验过程较为复杂, 步骤较多, 因此筛选到一部分看家基因也是正常现象.另一方面由于实验中各个步骤操作效率及mRNA丰度大小的差异, 部分NS3的反式激活基因也可能被漏掉, 并不能保证实验能够得到所有的反式激活靶基因. 本实验只是对反式激活的靶基因进行初步筛选分析, 是否是真正的NS3反式激活靶基因, 尚需进一步的研究加以证实. 但是由于不以研究对象的已知基因序列为前提, 为反式激活靶基因的研究提供了全新的探索方向, 不失为目前重要的研究技术和策略[64-69].
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