修回日期: 2002-11-15
接受日期: 2002-11-28
在线出版日期: 2003-04-15
筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的肝细胞结合蛋白基因, 并对新基因转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析, 探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制.
应用酵母双杂交技术, 以HCV的核心蛋白作为"诱饵(bait)", 筛选鉴定与其结合的肝细胞中蛋白的编码基因. 应用生物信息学(bioinformatics)技术, 分析其中筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)基因的全长编码序列, 并构建HCBP6基因的真核表达载体pcDNA3. 1(-)-HCBP6. 应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3. 1(-)-HCBP6转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测.
通过酵母双杂交技术的筛选和鉴定, 结合生物信息学分析, 确定人的HCBP6基因由456nt组成, 编码152aa的蛋白. 基因表达谱芯片所检测的1152条目的基因均为GenBank中登录的基因, HCBP6表达质粒转染的细胞有20条差异表达基因, 其中13条基因表达增强, 7条基因表达降低. 这些差异表达的基因与细胞信号转导、增生、分化及生长调节密切相关.
酵母双杂交技术结合生物信息学技术, 是克隆蛋白结合蛋白的有效方法, 基因表达谱芯片技术对于初步全面探索新基因的功能提供重要的资料. 本实验结果为进一步阐明HCV核心蛋白与Hcbp6相互作用后的肝细胞生物大分子变化提供了理论依据.
引文著录: 刘妍, 成军, 李克, 杨倩, 陆荫英, 王琳, 王建军. 丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析. 世界华人消化杂志 2003; 11(4): 394-398
Revised: November 15, 2002
Accepted: November 28, 2002
Published online: April 15, 2003
To screen and clone genes of hepatic protein interacting with hepatitis C virus (HCV) core protein and analyze the gene expression profiles of HepG2 cell transfected with HCV coreprotein-binding protein6 (HCBP6) gene.
Using yeast two-hybrid system3, bait plasmid of HCV coreprotein was constructed and genes encoding HCV coreprotein-binding protein were screened and identified. One gene named HCBP6 was identified. Humanfull-length encoding gene of HCBP6 and its amino acid sequences were identified by bioinformatics method, and there combined expression plasmidpc DNA3. 1(-)-HCBP6 was constructed. mRNA from HepG2 cell stransfected with pcDNA3. 1(-)-HCBP6 and the empty vector were detected with cDNA microarray, respectively.
Human HCBP6 cDNA sequence was identified. The coding sequence for human HCBP6 consists of 456 nt and its protein consists of 152 aa. Twenty of 1152 gene sobtained from gene expression profile analysis differed from those in GenBank, in which 13 genes were up-regulated and 7 genes were down-regulated in HepG2 cells transfected with HCBP6 plasmid. These genes differentially regulated by HCBP6 protein included human genes encoding proteins involved in signal transduction, cell proliferation, differentiation, and growth regulation.
The bioinformatics combined yeast two hybrid technique is a powerful method for screening and analysis of genes of hepatic protein interacting with HCV coreprotein. The findings obtained by cDNA microarray technique provided significant data for preliminary understanding of the biologica lfunction of new gene, and also provided some clues for furthe rclarifying the molecular biological processes of hepatocytes in interaction between HCV core protein and HCBP6.
- Citation: Liu Y, Cheng J, Li K, Yang Q, Lu YY, Wang L, Wang JJ. Gene expression profile of HepG2 cell transfected with hepatitis C virus coreprotein-binding protein6 gene. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2003; 11(4): 394-398
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v11/i4/394.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v11.i4.394
肝炎病毒蛋白与宿主蛋白相互作用, 可能是病毒感染导致肝细胞损伤、肝纤维化和肝细胞癌发生、发展的重要原因. 丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白是一种多功能蛋白质, 除了作为核壳蛋白具有病毒颗粒组装功能外, 还具有多种调控细胞及病毒基因表达、细胞凋亡、细胞增生与分化以及免疫调节等功能. 临床和实验研究显示HCV核心蛋白在病毒致病过程中起到重要的作用[1-7].
为更好地了解HCV核心蛋白与肝细胞蛋白之间的相互作用, 我们采用酵母双杂交系统3, 以HCV核心蛋白作为"诱饵", 对于肝细胞cDNA文库进行酵母双杂交筛选, 获得了一些与HCV核心蛋白结合的肝细胞蛋白的编码基因, 其中包括功能未知基因6号, 我们命名为HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6). 为进一步探索该基因的功能, 我们应用基因表达谱芯片技术(cDNAmicroarray)筛选HCBP6表达质粒转染HepG2细胞后的差异表达基因, 并应用生物信息学(bioinformatics)对差异表达的基因进行分析. 本研究为全面了解HCBP6基因在肝细胞中的生物过程提供理论基础.
应用酵母双杂交技术筛选HCV核心蛋白结合的肝细胞蛋白的研究原理、方法、操作步骤以及HCBP6基因真核表达载体的构建等参考基因治疗研究中心相关的研究论文[8-11].
在35mm培养皿中常规培养肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞(由本室保存), 细胞生长至对数期时, 分别以脂质体转染试剂LipofectaminePLUS(购自Invitrogen公司)将2mgpcDNA3. 1(-)-HCBP6和空载体pcDNA3.1(-)转染HepG2细胞, 48 h后收获细胞, 每5×106个细胞加入1 mL总RNA提取试剂Trizol(购自Invitrogen公司). 立即于液氮中保存. 使用Trizol试剂一步法提取HCBP6表达质粒pcDNA3.1(-)-HCBP6和空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞总RNA(分别标记为实验组和对照组), 样品经分光光度计检测吸光度A值, 并行热稳定实验, 于-20 ℃和70 ℃保温1 h后, 经琼脂糖凝胶电泳检测28S、18S条带变化. 以Qiagen公司OligotexmRNAMidiKit纯化得mRNA. 操作按说明书进行, 并行电泳检测.
参照Yang etal[14]方法逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA(5mg), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5mg). 乙醇沉淀后溶解在20 μL5×SSC+2 g/LSDS杂交液中. 芯片包含的1152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因和抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1-3 kb. 靶基因以0.5 μg/mL溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian7500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(0.5 h), UV交联, 再分别用2 g/LSDS、水及2 g/L的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.
将基因芯片和杂交探针95 ℃水浴变性5 min, 将混合探针加在基因芯片上, 置于60 ℃杂交15-17 h. 依次以2×SSC+2 g/LSDS、1 g/L×SSC+2 g/LSDS、1 g/L×SSC洗涤10 min, 室温晾干.
用GeneralScanning公司的ScanArray3000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断: Cy5/Cy3>1.8, 红色荧光, 显示表达增强；Cy5/Cy3<0.7, 为绿色荧光, 显示表达减低.
经过以HCV核心蛋白为"诱饵"的肝细胞cDNA文库的酵母双杂交, 筛选出与HCV核心蛋白结合的一系列阳性克隆. 根据克隆的随机编号, 将这一基因编码产物命名为HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6), 该基因由456nt组成, 编码152aa组成的蛋白[8-11].
提取HCBP6表达质粒pcDNA3.1(-)-HCBP6和空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞总RNA, 测得吸光度A260/A280>1.90, 热稳定实验70 ℃保温1 h与-20 ℃1 h电泳条带比较, 显示28S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA. mRNA主要集中于0.9-4.0 kb的连续条带.
在芯片上共有1152个cDNA. 为了监控芯片杂交技术体系的整个过程, 在芯片上设置了阴性对照(8条水稻基因, 共8个点), 这些点的杂交信号均很低, 证实了数据的可靠性. 由于实验组探针标记Cy5荧光素(呈红色), 对照组探针标记Cy3荧光素(呈绿色), 红绿颜色的差异就显示该基因在实验组和对照组中基因表达水平上的差异, 黄色代表表达水平无差异. 按阳性标准, 从1152个基因中筛选出差异表达基因共20条, 其中13条基因表达增强, 7条基因表达降低.
表达增强的基因主要有四类: (1)细胞生长调节相关基因, 如胰腺肿瘤相关蛋白, 神经纤维瘤病2肿瘤抑制蛋白斯库瓦诺明的相互作用蛋白1以及20号染色体开放读框1等; (2)细胞信号转导相关基因, 如表皮生长因子受体, 神经生长因子β多肽, 跨膜受体蛋白, 蛋白磷酸酶2调节亚基等；(3)DNA复制及翻译相关基因, 如RNA结合基序蛋白, 微小染色体维持缺陷3蛋白, 新生多肽相关复合体等；(4)免疫调节因子, 如白介素10受体. 表达增强的基因(表1). 表达降低的基因主要有: (1)过氧化酶相关基因, 如细胞质的环氧化物水解酶, 过氧化物歧化酶等; (2)线粒体相关的基因, 如细胞色素P450等. 表达降低的基因(表2).
| GenBank 登录号 | 编码蛋白 | Cy5/Cy3 |
| NM_005228 | 表皮生长因子受体epidermal growth factor receptor (EGFR) | 1.803 |
| NM_025263 | 来源自MHC-I 分子的富含脯氨酸的蛋白CAT56 protein (CAT56) | 1.833 |
| NM_003564 | 平滑肌分化特异性蛋白transgelin 2 (TAGLN2) | 1.835 |
| NM_005777 | RNA 结合基序蛋白RNA binding motif protein 6 (RBM6) | 1.856 |
| NM_002506 | 神经生长因子β多肽 nerve growth factor， beta polypeptide (NGFB) | 1.896 |
| AF311912 | 胰腺肿瘤相关蛋白 pancreas tumor-related protein (FKSG12) | 1.941 |
| NM_001558 | 白介素10受体interleukin 10 receptor， alpha (IL10RA) | 1.959 |
| Z17227 | 跨膜受体蛋白transmebrane receptor protein | 1.983 |
| NM_014225 | 蛋白磷酸酶2调节亚基protein phosphatase 2， regulatory subunit A (PR 65) | 2.083 |
| NM_002388 | 微小染色体维持缺陷3 蛋白minichromosome maintenance deficient 3 (MCM3) | 2.262 |
| NM_014575 | 神经纤维瘤病2 肿瘤抑制蛋白schwannomin 的相互作用蛋白1 schwannomin interacting protein 1 (SCHIP1) | 2.362 |
| NM_012112 | 20号染色体开放读框1 chromosome 20 open reading frame 1 (C20orf1) | 2.486 |
| NM_005594 | a polypeptide (NACA) | 4.750 |
| GenBank 登录号 | 编码蛋白 | Cy5/Cy3 |
| NM_005161 | 血管紧张素受体样蛋白1 angiotensin receptor-like 1 (AGTRL1) | 0.485 |
| NM_000732 | T 细胞抗原受体相关的复合物δ链 CD3D antigen， delta polypeptide (TiT3 complex) (CD3D) | 0.512 |
| NM_001423 | 上皮膜蛋白1 epithelial membrane protein 1 (EMP1) | 0.545 |
| NM_001979 | 细胞质的环氧化物水解酶epoxide hydrolase 2， cytoplasmic (EPHX2) | 0.611 |
| NM_000104 | 细胞色素氧化酶P450 cytochrome P450 | 0.665 |
| NM_000699 | 胰腺淀粉酶α 2A amylase， alpha 2A; pancreatic (AMY2A) | 0.678 |
| NM_000454 | 过氧化物歧化酶 superoxide dismutase 1， soluble (SOD1) | 0.689 |
HCV基因组含有单一的开放读码框架, 编码3010-3033个氨基酸残基的多肽前体, 两侧是5'-非翻译区及3'-非翻译区. 多肽前体至少被加工为10种结构蛋白和非结构蛋白, HCV各结构和非结构蛋白在肝细胞内并不是孤立存在的, 与宿主肝细胞蛋白之间相互作用可能是HCV致病的分子生物学基础[12-17]. HCV核心蛋白是一种多功能蛋白质, 除了作为核壳蛋白具有病毒颗粒组装功能外, 还调控多种细胞及病毒基因启动子的活性, 具有广泛的反式调节作用. 研究显示, 核心蛋白可以和宿主的多种蛋白质如淋巴毒素b受体、核糖核蛋白K、RNA螺旋酶、DBX等相互作用, 影响细胞的正常生理过程[18-21]. 表达HCV核心蛋白的转基因鼠不仅引起肝脂肪变性而且引起肝细胞癌[22,23]. 可见HCV核心蛋白在HCV发病机制中起重要作用. 为进一步研究HCV核心蛋白与宿主肝细胞蛋白的相互作用, 我们用肝细胞cDNA文库与HCV核心蛋白诱饵进行酵母双杂交, 结合生物信息学分析, 筛选并克隆了与HCV核心蛋白相互作用的新的蛋白质基因HCBP6[9,11,24]. 我们构建了HCBP6基因的真核表达载体, 初步研究发现该基因的表达在一定程度上抑制了HCV核心蛋白对SV40早期启动子的反式激活作用. 本研究采用基因表达谱芯片方法筛选HCBP6基因转染细胞差异表达基因, 以期综合分析HCBP6基因的生物功能.
基因表达谱芯片是将大量的基因特异探针或其cDNA片段固定在一块基因芯片上, 对来源不同的个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激(包括不同诱导、不同治疗手段)下的细胞内的mRNA或逆转录产物cDNA进行检测, 从而大规模对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合分析和判断[25-28]. 本研究应用基因表达谱芯片对HCBP6表达质粒pcDNA3. 1(-)-HCBP6转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测, 通过分析二者之间基因表达的差异信息, 寻找HCBP6上调或下调的基因. 在1152个基因中筛选出20个差异表达基因, 这些差异调节基因大多与细胞信号传导、细胞增生分化、免疫调节、肿瘤发生等生物过程密切相关.
在表1的上调基因中, 有多条基因与细胞生长调节密切相关, 如神经纤维瘤病2肿瘤抑制蛋白斯库瓦诺明的相互作用蛋白1基因分布在人染色体3q25, 斯库瓦诺明是负性生长调节因子, 可以与肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶作用底物(HRS)相互作用, 发挥其生物功能[29]. 20号染色体开放读框1, 为细胞周期S、G2、M期增生相关的核蛋白P100, 该蛋白的检出预示肿瘤的预后差[30]. HCBP6蛋白通过调控上述基因的表达, 影响肝细胞基因的增生与分化, 可能是其协同HCV核心蛋白致病的主要机制之一. 一些细胞信号转导相关基因, 如表皮生长因子受体, 神经生长因子b多肽, 跨膜受体蛋白, 蛋白磷酸酶2调节亚基等基因的表达上调[31], 表明HCBP6蛋白参与了细胞信号转导及细胞增生与分化的调控, 影响肝细胞基因组的表达. 微小染色体维持缺陷3蛋白是DNA复制中起重要作用的核蛋白[32], 新生多肽相关复合体能够与核糖体携带的新生肽结合, 从而阻止新生肽与胞质中其他蛋白的异常相互作用, 此外, 该复合体是12号染色体的转录反式激活因子[33]. 可见HCBP6蛋白在调节DNA复制及蛋白翻译成熟修饰过程中起重要作用. 免疫调节因子, 白介素10受体表达增强, 提示HCBP6蛋白可能具有一定的免疫调节作用.
分析部分表达降低的基因主要有: 过氧化酶相关基因, 如过氧化物歧化酶, 在清除自由基介导的细胞内大分子损伤过程中起重要作用; 又如细胞质的环氧化物水解酶, 生理条件下, 能够水解经细胞色素P450催化产生的环氧化物为二醇, 自胆汁、尿中排泄. 当水解功能缺陷时, 环氧化物可在肝内蓄积, 与细胞内大分子物质共价结合, 导致一系列的病理改变. HCBP6基因通过下调上述基因的表达水平, 在一定程度上妨碍了肝细胞的损伤后修复, 扰乱肝细胞生长调节, 甚至诱发自身免疫性肝损害及肝癌. 此外, 线粒体能量代谢相关的基因, 如细胞色素氧化酶P450, 能够直接激活分子氧, 参与药物和毒物的转化. 该基因表达降低, 暗示机体对许多药物及毒物的摄取、转化发生障碍, 易积蓄中毒, 可见HCBP6基因通过下调细胞色素氧化酶P450的表达, 参与了肝脏的生物转化作用. HCBP6还下调T细胞抗原受体相关复合物δ链的表达, 参与T细胞免疫调节. 结合表1的结果, 我们发现HCBP6蛋白双相调节细胞的生长, HCBP6独自存在是否足以引起细胞病变, 还需要深入研究, 而与HCV核心蛋白相互作用可能是HCV的致病机制之一.
总之, 利用基因表达谱芯片对HCBP6蛋白差异调节基因的表达研究表明, 细胞内HCBP6蛋白的过表达引起的生物过程涉及许多不同基因表达的变化, 这些基因与细胞信号转导、细胞增生与分化、免疫调节、肿瘤发生、能量代谢及生物转化等生物过程密切相关. 本研究结果为进一步了解HCBP6基因的生物学功能及其与HCV核心蛋白相互作用过程中致病(癌)的分子生物学机制提供重要的线索.
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