丙型肝炎病毒核心区蛋白和细胞凋亡对HepG2细胞周期的影响

摘要

目的: 研究丙型肝炎病毒核心区(HCV-C)蛋白和细胞凋亡对肝癌细胞HepG₂细胞周期的影响.

方法: 首先运用基因重组技术构建包含HCV-C基因的真核表达质粒pcDNA3. 1, 然后利用脂质体介导将重组真核表达质粒转染肝癌细胞HepG₂, 经G418筛选获得稳定转染HepG₂ 细胞(HCV-C转染HepG₂细胞), 经RT-PCR和间接免疫荧光法证实其中有HCV-C蛋白表达. 然后进行如下实验: (1)MTT法检测HCV-C转染HepG₂细胞、空白质粒转染HepG₂细胞和未转染HepG₂细胞生长增生率; (2)流式细胞术(FACS)检测三组细胞凋亡率和细胞周期, 以及HCV-C转染HepG₂细胞经Fas抗体诱导凋亡后的细胞周期变化.

结果: (1)HCV-C转染HepG₂细胞增生率显著高于空白质粒转染HepG₂和未转染HepG₂细胞增生率; (2)细胞未经Fas抗体诱导凋亡时, HCV-C转染HepG₂细胞S期所占百分率高于未转染HepG₂细胞S期所占百分率, HCV-C转染HepG₂细胞凋亡率低于无HCV-C转染HepG₂细胞凋亡率; HCV-C转染HepG₂细胞经Fas抗体诱导凋亡时, 细胞S期所占百分率低于未经诱导凋亡细胞S期所占百分率.

结论: (1)HCV-C蛋白具有抑制HepG₂细胞凋亡的作用; (2)HCV-C蛋白促进HepG₂细胞从G_0/1期进入S期, 从而可能促进细胞生长增生, 抑制细胞凋亡; Fas抗体诱导细胞凋亡时细胞被阻滞于G_0/1期.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: October 7, 2002
Revised: October 11, 2002
Accepted: October 21, 2002
Published online: March 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)感染是引起输血后肝炎的主要病原体, 且HCV感染后大部分会导致感染慢性化, 可引起慢性丙型肝炎、肝炎后肝硬化及肝细胞癌(HCC)等严重后果. 目前对丙型肝炎的发病机制尚不清楚, 免疫损伤可能是其主要致病机制, 但HCV对肝细胞的直接作用也起着一定作用, 其中包括HCV对肝细胞增生和细胞周期的影响[1-3]. Kalkeri et al[4,5]发现转染了HCV全基因的细胞增生受到抑制; Werling et al[6]报道慢性丙型肝炎患者肝细胞增生率低于非HCV所致慢性肝炎的肝细胞增生率, 说明HCV具有抑制肝细胞增生的能力. 丙型肝炎病毒核心区(HCV-C)蛋白对细胞增生和细胞周期的影响还不清楚. 部分认为HCV-C蛋白抑制细胞凋亡促进细胞增生[7-9], 部分认为HCV-C蛋白抑制细胞增生[10]. 细胞周期分为G_0/1期、S期和G₂/M期, 细胞周期在不同时相的多个调控点上受到调控, 其中以G₁/S和G₂/M期转换调控点最为重要[11,12]. 细胞周期阻断与细胞凋亡关系不明确, 细胞周期阻断并不是越完全越促使细胞凋亡[13]. 本实验旨在研究HCV-C和细胞凋亡对细胞周期的影响.

1 材料和方法

1.1 材料

DNA纯化试剂盒(QIAGEN), 培养基DMEM, 脂质体Lipofectamine2000、抗生素G418(GIBCO), RT-PCR逆转录试剂盒(Promega), FITC标记山羊抗人IgG(武汉博士德), 兔抗人Fas多克隆抗体(Santa Cruz). 含有HCV-C, E1, E2区的质粒puc118由本所谭德明教授构建并赠送; 质粒pcDNA3. 1(+)、大肠杆菌JM109及肝癌细胞系HepG2由我科保存; 流式细胞仪(FACS420).

1.2 方法

1.2.1 PCR引物: 根据HCV1a序列(AF009606)设计能扩增全长HCV-C的引物(分别在两端引入酶切位点HindⅢ及EcoRⅠ, 并在下游设计终止密码), 上游引物: ACAAGCTTCCCATGAGCACGAATCCTAAAC, 下游引物 AGAATTCCTAGGCTGAAGCGGGCACAGTC, 预计扩增片段长度为594 bp.

1.2.2 构建包括目的基因HCV-C的重组真核表达质粒[14,15] 首先以包括HCV-C、E1和E2区的重组质粒Puc118为模板进行PCR扩增目的片段HCV-C, 将纯化的PCR产物与T载体(3 000 bp)经T₄ DNA连接酶4℃连接过夜, 经氨苄青霉素筛选阳性克隆, 并经HindⅢ、EcoRⅠ双酶切和PCR鉴定证实. 然后利用基因重组技术构建包括目的片段HCV-C的重组真核表达质粒pcDNA3. 1(约5 400 bp), 经抗生素筛选, PCR扩增、HindIII和EcoRI双酶切以及重组质粒DNA序列测定证实重组真核表达质粒中包含目的片段HCV-C, 说明含有目的基因HCV-C的重组真核表达质粒构建成功.

1.2.3 重组真核表达质粒转染肝癌细胞HepG₂: 提取的重组真核表达质粒及空白质粒pcDNA3. 1经脂质体介导转染肝癌细胞HepG₂, 经G418筛选获得稳定转染重组真核表达质粒的HepG₂细胞(分别称为HCV-C转染HepG₂和空白质粒转染HepG₂).

1.2.4 RT-PCR和间接免疫荧光法检测HCV-C转染HepG₂中HCV-C表达: 按Trizol RNA提取试剂盒说明提取细胞RNA, 行RT-PCR检测HCV-C转染HepG₂细胞中有无HCV-C mRNA表达. 将细胞置于放有盖玻片的6孔细胞培养板中培养48 h后, 细胞经冷丙酮固定30 min, 滴加山羊血清室温孵育20 min封闭; 以丙型肝炎抗体阳性患者血清(1: 8)作为一抗孵育2 h, FITC标记的山羊抗人IgG(1: 32)为二抗37℃孵育1 h, 然后经PBS漂洗3次×5 min; 于荧光显微镜下观察HCV-C转染HepG₂细胞中有无HCV-C 表达.

1.2.5 MTT法检测HCV-C蛋白对HepG₂细胞增生率的影响[15]: 分别接种2×10⁴个 HCV-C转染HepG₂、空白质粒转染HepG₂和未转染HepG₂细胞于96孔细胞培养板中培养48 h后, 使用MTT(四甲基偶氮唑蓝)法检测细胞生长率.

1.2.6 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况: 分别传代2×10⁵个HCV-C转染HepG₂、空白质粒转染HepG₂和未转染HepG₂细胞至6孔细胞培养板中培养72 h, 细胞经胰酶消化后用冷70 ml/L乙醇固定细胞于4℃保存, 细胞经流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期情况. Fas抗体诱导HepG₂细胞凋亡: HCV-C转染HepG₂首先培养48 h后加入Fas抗体(200 ng/mL)后再培养24 h[16-20].

统计学处理 利用SPSS10.0软件进行统计分析: 数据用表示, 多组之间进行比较采用方差分析, 当P<0.05时, 采用LSD法分别进行两两比较; 两组之间进行比较采用成组设计t检验, 并以P<0.05确定差异是否具有显著性.

2 结果

2.1 重组真核表达质粒经PCR扩增可见600 bp左右的目的片段条带, HindIII 和EcoRI双酶切(图1), DNA序列测定说明包括HCV-C序列的重组真核表达质粒构建成功, 与HCV1a基因进行同源性比较符合率为98. 6%, 无移码突变.

图1 重组真核表达质粒双酶切鉴定. 泳道M, D: DNA marker; 泳道1, 2: 酶切后重组真核表达质粒; 泳道3: 未酶切重组真核表达质粒.

2.2 经RT-PCR和间接免疫荧光法检测证实HCV-C转染HepG₂细胞中有HCV-C mRNA和蛋白质表达, 而未转染HepG₂ 细胞和空白质粒转染HepG₂细胞中无HCV-C表达.

2.3 图2结果显示HCV-C转染HepG₂细胞组生长增生率(0.32±0.04)高于空白质粒转染HepG₂组(0.26±0.06)和未转染细胞组(0.26±0.05)(P<0.05), 说明HCV-C蛋白促进HepG₂细胞生长增生.

图2 HCV-C蛋白对细胞增生.

2.4 表1结果说明细胞未经Fas抗体诱导凋亡时, HCV-C转染HepG₂细胞凋亡率低于未转染HepG₂细胞凋亡率, 同时HCV-C转染HepG₂细胞S期所占百分率高于未转染细胞HepG₂细胞S期所占百分率(P<0. 05); 二组细胞之间G_0/1期所占百分率比较没有统计学差异(P>0.05), 但HCV-C转染HepG₂细胞仍低于未转染HepG₂细胞; 二组细胞之间G₂/M期所占百分率没有显著性差别(P>0.05). 以上结果说明HCV-C蛋白促进HepG₂细胞从G_0/1期向S期转化, 而对G₂/M期没有影响. 表2结果显示HCV-C转染HepG₂细胞经Fas抗体(200 ng/mL)作用后凋亡率显著增加(P<0.001), 并且细胞凋亡增加时S期所占百分率少于未经Fas抗体诱导凋亡对照组S期所占百分率(P<0.05); G_0/1期所占百分率与未经Fas抗体诱导凋亡对照组比较虽统计学上没有差异(P>0.05), 但经Fas抗体诱导凋亡组仍高于未经Fas抗体诱导凋亡组; 二组细胞之间G₂/M期所占百分率没有显著性差异(P>0.05). 说明Fas抗体诱导细胞凋亡时也是作用于G₁/S调控点, 使HCV-C转染HepG₂细胞阻滞于G_0/1期, 而对G₂/M期没有影响.

表1 HCV-C蛋白对HepG₂细胞周期的影响(mean±SD,%).

细胞组别	n	G0/1期	S期	G2/M	期细胞凋亡率
未转染细胞组	6	71.50±6.08	15.17±3.87	13.33±2.63	8.63±0.72
HCV-C转染组	6	66.55±2.09b	19.43±1.85a	14.02±1.41b	5.17±0.76a

^aP<0.05 vs 未转染细胞组;

^bP>0.05 vs 未转染细胞组.

表2 细胞凋亡对HCV-C转染HepG2细胞周期的影响(mean±SD, %).

细胞组别	n	G0/1期	S期	G2/M期	凋亡率
未诱导凋亡对照组	6	66.55±2.09b	19.43±1.85a	14.02±1.41b	5.17±0.76a
Fas抗体诱导凋亡组	4	70.43±3.61	15.13±2.20	14.45±1.69	14.43±1.13

^aP<0.05 vs Fas抗体诱导凋亡组;

^bP>0.05 vs 未转染细胞组.

3 讨论

目前公认HCV-NS5和NS3蛋白具有促进细胞增生、抑制细胞凋亡的功能[21-24]; 而HCV-C蛋白对细胞增生的影响还没有定论. 细胞增生、死亡是受细胞周期调控的, 细胞周期分为G_0/1期、S期和G₂/M期, 其中最关键的两期为S期和M期. 不同生物细胞增生周期时间不同, 主要是由G₁期持续时间所决定的, 而且G₁启动是细胞周期启动的关键, 因此G₁/S期的调控尤为重要. 本实验结果表明HCV-C蛋白主要作用于G₁/S调控点, 促进HepG₂细胞由G₁期进入S期, 由此可能启动并加速细胞周期进程, 促进细胞增生和抑制细胞凋亡. 但HCV-C蛋白作用于G₁/S调控点的机制有待进一步研究. Cho et al[8]发现HCV-C蛋白通过上调细胞中cyclin E促进细胞增生; Kwun et al[22]发现HCV-C蛋白通过抑制P21促进细胞增生. 当HCV-C转染HepG₂细胞经Fas抗体诱导凋亡时S期百分率减少, 细胞被阻滞于G₁期. 增生细胞对某些凋亡诱因的敏感性常依赖于细胞周期, 本实验结果表明不管是HCV-C蛋白抑制细胞凋亡, 还是由Fas抗体诱导细胞凋亡增加时都不是作用于G₂/M期. 细胞周期阻断与细胞凋亡关系不明确, 并不是细胞周期阻断越完全越促使细胞凋亡; 细胞周期阻断并不直接诱导细胞凋亡, 他可能是细胞凋亡的重要前提[25]. 细胞凋亡和增生分化是独立的两种方式, 但细胞凋亡和增生分化可同时存在; 细胞凋亡可发生在细胞周期不同时相. 细胞凋亡与细胞增生并非一定成负相关, 许多研究证明肿瘤组织含有激活的癌基因, 但细胞却出现大量死亡; 在慢性丙型肝炎患者肝细胞凋亡率和增生率可能同时升高, 但存在增生/凋亡失衡[26]. 目前已知具有致凋亡作用的C-myc和腺病毒蛋白E1A都是细胞增生的诱导物.

备注

编辑: N/A

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