肝硬化门静脉高压症大鼠脾脏血管内皮细胞生长因子的研究

摘要

目的: 探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)在肝硬化门静脉高压症中的作用.

方法: 对18例肝硬化门静脉高压症大鼠(分早期、中期、晚期三期)和6例正常大鼠脾脏切除标本, 使用原位杂交法检测VEGF的mRNA的表达情况.

结果: 门静脉高压组大鼠VEGF的mRNA高表达, 其表达率分别为早期50.0%, 中期 66.7%, 晚期100%. 对照组阳性表达率为16.7%.

结论: (1)VEGF是最有力的血管生成因子. (2)VEGF随肝硬化门脉高压严重程度而阳性表达率有所增加.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: October 25, 2002
Revised: November 6, 2002
Accepted: November 16, 2002
Published online: March 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

门静脉高压症(portal hypertension, PHT)与肝硬变密切相关, 其并发症多由于肝硬变引起的门静脉系统及体循环血流动力学变化所致. 在PHT患者, 除有血流动力学紊乱外, 还有门静脉系统血管的病变, 称为门静脉高压性血管病变(portal hypertension vascular lesion), 并在PHT的发展中起重要作用. 而VEGF是引起门静脉高压性血管病变的重要细胞因子之一. 本文通过动物实验, 测定大鼠脾脏VEGF的mRNA表达水平, 初步探讨VEGF在PHT中的作用.

1 材料和方法

1.1 材料

动物模型: 二级Wistar大鼠, 质量在200±30 g之间(第四军医大学实验动物中心SPF动物), 随机分为实验组(18只)和对照组(6只).

1.2 方法

实验组用600 mL/L四氯化碳橄榄油溶液按0.3 mL/100 g质量皮下注射, 1次/4 d, 饮用50 mL/L乙醇, 参照韩德五et al[1]将肝硬变大鼠模型分期, 人为地将肝硬变大鼠病程分为三期: 早期(第25天)脂变坏死期; 中期(第45天)纤维增生期; 晚期(第65天)假小叶形成期. 对照组用橄榄油溶液0.3 mL/100 g质量皮下注射, 1次/4 d, 饮用自来水. 二组大鼠均在二级动物实验室饲养, 自由进食. 大鼠断头处死. 迅速取出脾脏放入-173℃液氮冷冻保存. 血管内皮细胞生长因子(VEGF)的mRNA测定: 采用原位杂交法. 选用武汉博士德生物工程有限公司生产的VEGF原位杂交检测试剂盒; APES胶片; DEPC; POLY-L-LYSINE; DAB显色试剂盒. 采用地高辛标记的随机引物法, 原位杂交的具体方法参照蔡文琴 et al[2]方法进行. 免疫显色半定量判定标准: 按显色的深度和阳性颗粒的粗细、数量分为三级, 显色略高于背景、阳性颗粒细而少为弱阳性; 显色为深褐色或棕褐色、颗粒粗大而多为强阳性; 界于二者之间者为中度阳性. 阳性颗粒在每个高倍镜视野中占30%以上为阳性切片; 每个标本连续取5张切片染色, 其中有一个阳性切片既为阳性结果.

统计学处理 运用SAS统计软件作统计分析. 比较阳性切片和阴性切片在每组中的统计学差异, 采用Fisher's精确检验行统计学处理.

2 结果

门静脉高压组大鼠VEGF的mRNA高表达, 其表达率分别为, 早期50%(3/6), 中期66.7%(4/6), 晚期100%(6/6). 对照组仅有1例轻度阳性, 阳性率为16.7%(表1). 由Fisher's精确检验可计算出P<0.05(表2), 说明VEGF在门静脉高压组同对照组之间, 以及门静脉高压不同时期组间均有显著性差异. VEGF的mRNA 表达随肝硬化门脉高压严重程度而有所增高.

表1 各组大鼠切片阳性结果比较.

分组	正常	早期	中期	晚期	合计
阴性	5	3	2	0	10
阳性	1	3	4	6	14
合计	6	6	6	6	24

表2 由Fisher's精确检验计算出的P值(n = 24).

Fisher's Exact Test
Table Probability (P)	9.178E-04
Pr< = P 0.0350

3 讨论

血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor)是1989年Ferrara et al[3]在牛垂体星状细胞体外培养分离出的一种糖蛋白, 其在体内外都表现出特异性地促进血管内皮细胞生长并诱导血管生成的作用, 故被称为血管内皮细胞生长因子(VEGF). 在众多的血管生成因子中, VEGF是最有力的血管生成因子, 他通过和血管内皮细胞的特异性受体结合, 具有强大的促内皮增生、促血管生成作用. 门静脉系统血管病变已经成为PHT目前研究的热点之一[4]. 而脾内血管病变也是门静脉高压性血管病变的一部分. 本实验表明, 随着肝硬化程度的加重, VEGF的表达有增高趋势, 而VEGF具有较强的促血管内皮细胞增生及增加血管通透性的作用[5], 使脾脏内血管增生, 脾内储血量加大导致脾髓压力升高, 从而加重门静脉高压状态和脾功能亢进. 这说明, 在肝硬化渐变中, VEGF起着重要的作用. 肝内外分流时, 胃肠胰源性所释放的舒血管活性物质, 使三级小动脉阻力下降, 血管扩张, 动-静脉短路形成, 血氧饱和度下降. 由于缺血、缺氧、内毒素及肝功能下降等导致代谢紊乱, 包括脾脏在内的内脏处于高血流动力状态. 而缺氧条件下可导致VEGF的表达及释放, 并为血管生成的因素之一[6]. 因此随着肝硬化程度的进一步加重, VEGF的表达更趋升高, 对肝硬化严重程度起正反馈性调节作用.

总之, VEGF的高表达不但是门静脉高压作用的结果, 同时也是门静脉高压的促进因素. 由于VEGF在体内所表现出的特异性促血管生成作用, 使其在临床应用方面表现出广泛的应用前景. 然而, 对VEGF的详细表达调节机制尚有待于进一步研究. 利用其血管生成作用机制, 通过抑制VEGF的血管生成作用治疗肝硬化门静脉高压症, 正在作为一种新的治疗方法被应用于临床.

备注

编辑: N/A

参考文献

1.	韩 德五, 马 学慧, 赵 元. 肝硬化动物模型研究. 山西医药杂志. 1979;4:1.  [PubMed]  [DOI]

2.	蔡 文琴, 王 伯云. 实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术. 第1版. 成都: 四川科学技术出版社 1994; 401-427.  [PubMed]  [DOI]

3.	Ferrara N, Henzel WJ. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 1989;161:851-858.  [PubMed]  [DOI]

4.	Yang Z, Liu R, Yang R, Qui F. Portal hypertensive vascular lesions. J Tongji Med Univ. 1996;16:32-35.  [PubMed]  [DOI]

5.	Veikkola T, Alitalo K. VEGFs, receptors and angiogenesis. Semin Cancer Biol. 1999;9:211-220.  [PubMed]  [DOI]

6.	Shweiki D, Itin A, Soffer D, Keshet E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. 1992;359:843-845.  [PubMed]  [DOI]