修回日期: 2002-08-13
接受日期: 2002-08-23
在线出版日期: 2003-03-15
肝纤维化的特征性变化是肝内细胞外基质的过多沉积. 抑制肝星形细胞的激活和细胞外基质的合成, 促进基质降解和肝细胞再生是肝纤维化治疗的重要方法. 近年来, 针对上述环节构建重组复制缺陷型腺病毒, 表达不同外源基因产物基因治疗肝纤维化研究取得了较大的进展. 本文对重组腺病毒的结构、构建以及抗肝纤维化作用和安全性研究作一综述.
引文著录: 林勇, 陈伟忠, 谢渭芬, 张忠兵. 重组复制缺陷型腺病毒基因治疗肝纤维化的研究与应用. 世界华人消化杂志 2003; 11(3): 321-325
Revised: August 13, 2002
Accepted: August 23, 2002
Published online: March 15, 2003
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2003; 11(3): 321-325
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v11/i3/321.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v11.i3.321
肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是肝脏对慢性损伤的一种修复反应, 是慢性肝病共有的病理改变, 其特征性改变是肝内细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的过多沉积. 近年来, 针对肝纤维化发生的各个环节, 如抑制肝星形细胞(hepatic stellate cell, HSC)激活和ECM合成, 促进基质降解和肝细胞再生等方面, 构建了各种携带外源目的基因的病毒载体, 为肝纤维化的基因治疗提供了有力的手段[1-4]. 由于复制缺陷型腺病毒能较好地克服以往病毒载体的缺点, 加之其具有宿主范围广、可感染分裂期及静止期细胞、包装容量大、不发生整合、繁殖滴度高、性质稳定等优点, 业已成为基因治疗中被广泛应用的载体系统. 随着腺病毒载体广泛应用于基因治疗等医学研究领域, 构建重组腺病毒的方法也有了新的突破[5,6]. 本文将应用重组复制缺陷型腺病毒基因治疗肝纤维化的研究进展作一综述.
人腺病毒(adenovirus, Ad)是一群分布广泛的呼吸道病毒, 无包膜的对称20面体. Ad基因组为双股DNA, 呈线性, 36 Kb, 分早期转录区和晚期转录区, 前者有E1、E2、E3、E4四个区, 编码病毒调节蛋白; 后者分L1、L2、L3、L4、L5五个区, 编码病毒结构蛋白. 目前对人腺病毒的分子生物学特性研究最为详细的是人腺病毒2型(adenovirus type 2, Ad2)和人腺病毒5型(Ad5), 大多数腺病毒载体就是以Ad2和Ad5为基础构建的. 为了在病毒基因组的特定位点插入目的基因, 并得到能够表达外源基因的重组病毒, 传统方法通常造成E1和/或E3区缺失, 使病毒复制缺陷, 同时在E1、E2、E3、E4等位置将含有外源基因的酶切片段与腺病毒基因组片段在DNA连接酶的作用下, 直接进行体外连接, 然后转染细胞; 或将带有外源基因和同源区的穿梭质粒与病毒的核酸大片段共转染哺乳动物包装细胞293或911, 在相关酶系的作用下, 通过同源重组机制获得表达外源基因的复制缺陷型重组病毒[7-10]. 这二种方法繁琐低效的缺点限制了腺病毒载体的更广泛应用. 随着腺病毒载体基因治疗研究的不断深入, 构建重组腺病毒的方法有了很大的改进. Okada et al[11]通过同源重组产生的复制缺陷性腺病毒AVC2. null感染293细胞, 分离AVC2. null DNA-蛋白质复合物, 使用二种黏端酶酶切得到非互补5'黏末端, 再与同样酶切处理的外源基因片段直接相连. 因为只有通过外源基因才能将DNA-蛋白质复合物的左右臂端连接起来, 故不再需要对病毒进行筛选和噬斑纯化, 缩短了构建的过程.
He et al[12]建立了在大肠杆菌内重组腺病毒的pAdEasy系统. 通过已插入外源目的基因的穿梭质粒腺病毒的左臂和右臂同源区与骨架载体上腺病毒基因组在大肠杆菌内同源重组, 由于借助了细菌细胞内高度有效的同源重组机制并能进行抗生素筛选, 可以在很短的时间内得到所需要的重组腺病毒质粒, 再通过PacⅠ内切酶线性化, 去除质粒上的ori和卡那霉素抗性编码基因, 并暴露其ITR序列后, 在适当的包装细胞内就可得到表达外源基因的重组腺病毒. 同时利用在同源重组时整合入腺病毒骨架中的绿色荧光蛋白(GFP), 可以直接地观察转染和感染的效率, 大大方便了腺病毒的重组与纯化. 与传统方法相比, 新的构建重组腺病毒的策略具有其他策略不可比拟的优势[13,14].
由于肝纤维化的发生发展涉及多个环节, 许多学者设计并构建了围绕肝纤维化相关环节的多种重组复制缺陷型腺病毒, 并通过重组腺病毒将外源目的基因导入细胞或动物体内, 以达到抑制纤维生成, 促进肝细胞再生和肝脏结构重建的效果. 一系列体内和体外实验显示重组腺病毒在肝纤维化基因治疗中有着很好的治疗效果和应用前景, 也为肝纤维化的治疗提供了新的思路[15].
HSC的激活是肝纤维化发生的中心环节, 其激活过程分为启动阶段和持续阶段. 前者指基因表达和表型的早期变化使其具有对细胞因子和刺激的反应性, 后者指由于这些刺激的作用而维持HSC的激活状态并导致ECM合成. 抑制静止的HSC转变为活化的肌成纤维样细胞是抗肝纤维化治疗的一个重要途径[16].
内皮素-1(endothelin-1, ET-1)是调节HSC收缩的主要因子. 其受体有ETA和ETB二种, 广泛存在于肝脏各种细胞, 但以HSC最为丰富[17]. Yu et al[18]研究发现, 一氧化氮(NO)能有效地缓解ET-1所引起的HSC的收缩, 利用重组腺病毒构建含有鼠神经元一氧化氮合酶同工酶(nNOS) cDNA的表达载体Ad. nNOS, 体外转染至肝细胞、肝窦内皮细胞和HSC, 结果均有NOS表达, 其中HSC表达量最高. 经股静脉注射Ad. nNOS至肝损伤大鼠, 能明显地促进NO的合成, 抑制ET-1的表达, 缓解由ET-1介导的HSC收缩和激活; 同时明显减轻肝硬化小鼠肝内血流阻力和门脉压力.
抑制ECM的产生一直是抗肝纤维化治疗的主要目标, 包括抑制TGFβ1等细胞因子的活性, 或直接抑制ECM的合成和修饰[17,19-21]. Qi et al[22]利用复制缺陷型腺病毒载体(E1和E3区缺失), 构建由巨细胞病毒增强子和肌动蛋白启动子驱动的缺失型II型TGF-β受体重组腺病毒(该缺失型受体可与野生型TGF-β受体竞争结合TGF-β, 但无激活作用, 从而阻断TGF-β的活性), 经门静脉注射治疗二甲基亚硝胺(DMN)肝损伤大鼠, 免疫组化显示可显著抑制肝脏I型胶原、FN 、TGF-β1等表达, 治疗组肝纤维化仅为对照组的22%, 大鼠生存率明显提高. Ueno et al[23]将可溶性缺失型II型TGF-β受体重组腺病毒AdTbeta-ExR (该载体插入的外源目的基因表达的产物含有II型TGF-β受体的膜外区, 可与人IgG Fc端相结合)注射至肝纤维化小鼠肝脏以外的其他器官如骨骼肌, 表达产物-缺失型II型TGF-β受体亦可在3 wk内检测到, 通过阻断TGF-β的传导信号, 明显地减少了肝纤维化小鼠肝脏羟脯氨酸的合成, 同时未出现明显副作用. 研究发现, 一些具有抗炎作用的细胞因子亦能影响肝纤维化的进程, 部分细胞因子则可抑制HSC的激活和ECM的合成[24-26]. Zhang et al[27]将携带有鼠γ-干扰素(IFN-γ) cDNA的重组腺病毒载体体外转染至正常小鼠肝细胞株BNL CL. 2, 然后将这些肝细胞通过脾脏内注射移植于肝纤维化小鼠, 治疗4 wk后肝纤维化小鼠肝脏中I 型和III型胶原表达明显下降; 通过RNA斑点杂交方法检测到治疗组小鼠肝脏中TGF-β1 和其受体的表达亦明显下降.
肝纤维化的实质是慢性肝损伤的修复反应, 导致以胶原为主的ECM各成分合成增多, 降解相对不足, 致使ECM在肝内过多沉积. 因此, 促进ECM各成分的降解无疑是抗肝纤维化治疗的另一重要途径[28].
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一组锌酶, 是降解胶原、蛋白多糖等ECM的主要蛋白酶. MMPs至少包括3类: 间质型胶原酶、IV型胶原酶和基质溶素. 肝纤维化早期, MMPs轻度增高, 而肝纤维化中晚期MMPs活性则明显降低, 以致ECM合成超过降解, 引起ECM大量沉积. 通过调节MMPs活性, 有助于增加基质的降解, 促进肝纤维化的逆转.
纤溶酶原激活剂(plasminogen activator, PA)包括组织型(tissue-type plasminogen activator, tPA)和尿激酶型(urokinase-type plasminogen activator, uPA)二种. tPA主要参与纤溶过程, 而uPA主要作用于生理病理条件下细胞迁移、组织重建、肿瘤浸润及转移等过程, 包括ECM的降解, 也参加部分纤溶过程. 通常uPA蛋白合成后, 穿过内质网膜并通过高尔基体分泌至细胞外. 目前研究证实, 纤溶酶原激活剂/纤溶酶系统是调节MMPs活性和ECM降解的关键因素. MMPs以酶原的形式分泌, 在纤溶酶的作用下, 伴随失去约10 kD的片段而被激活; 同时纤溶酶也可直接降解ECM. 纤溶酶由uPA所激活, 而被纤溶酶原激活剂抑制因子1(PAI-1)所抑制[29]. Lieber et al[30]构建了uPA的腺病毒表达载体, 同时在uPA的cDNA两端进行了修饰: 氨基端加入RR固定信号序列, 羧基端加入了KDEL信号序列, 使外源表达的uPA蛋白的两端可以与内质网膜上的跨膜蛋白相结合, 从而固定于细胞内, 由分泌型转变为非分泌型. 研究显示经过上述修饰后, uPA蛋白保留在细胞内, 可激活MMPs, 降解ECM, 并促进肝细胞再生, 同时由于uPA蛋白不分泌到细胞外, 因而避免了对凝血功能的影响, 这一点对于有凝血功能障碍的肝硬化患者尤为重要.
Salgado et al[31]研究了这种非分泌型的uPA重组腺病毒对肝纤维化小鼠的治疗作用. 发现通过髂静脉注射uPA重组腺病毒后, 可增强纤溶酶和MMP-2的活性, 进而促进ECM各种成分的降解, 与对照组相比, 治疗后10 d肝纤维化程度降低85%, 纤维化肝脏α-SMA阳性细胞仅为对照组的50%; 同时肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)及其c-met受体表达增加, 肝细胞增生明显增强, 这可能与uPA激活HGF并形成双链的活性产物有关, 此外还可能与ECM降解导致肝组织结构改建和血管新生, 使肝细胞增生空间扩大有关.
HGF最初作为肝细胞强效的促分裂剂而应用于肝功能衰竭的治疗. HGF由728个氨基酸组成, 活性成分是由α链(64 kDa)和β链(34 kDa)组成的异源二聚体, 其前体分布于肝脏、脾脏、肾脏以及肾上腺等组织, 最终于肝脏中被灭活. 亦有实验证明, HGF可抑制HSC的激活和ECM的合成, 具有一定的抗肝纤维化作用[32-37]. Phaneuf et al[38]构建了由CMV驱动并插入人HGF cDNA的重组腺病毒Ad. CMV. rhHGF, 分别以(1-4)×1011pfu静脉注射正常小鼠, 5 d后发现治疗组小鼠肝细胞DNA合成和肝脏重量明显增多, 并有剂量依赖性. 在3×1011pfu剂量下, 作用最为明显, 肝脏重量增加至130%; 更为重要的是, 治疗组中腺病毒的肝脏毒性明显低于对照组, 说明外源表达的HGF可缓解腺病毒本身对肝脏的损伤.
研究显示, 激活的TGF-β可诱发肝细胞的凋亡, 抑制肝细胞的再生[39]. Nakamura et al[40] 将缺失II型TGF-β受体重组腺病毒质粒AdTbeta-TR经静脉注入肝纤维化小鼠, 不仅可以阻止TGF-β与野生型受体结合, 减轻基质的沉积, 还可明显促进肝细胞的再生.
细胞周期的研究发现, 培养细胞在G1期, 通过一些基因的表达, 可诱发细胞由G1期向S期转化, 复制增生. Nelsen et al[41]将体外构建的含有cyclin E和skp2的表达载体(cyclin E和skp2可促进细胞由G1期进入S期)转染至肝细胞, 可在无促有丝分裂剂的情况下促进肝细胞增生, 为肝细胞再生提供了新的方法.
端粒和端粒酶与细胞增生密切相关[42-44]. 端粒酶维持端粒长度是促进细胞增生的重要机制, 永生化细胞和恶性肿瘤细胞往往通过激活端粒酶来维持端粒长度并阻止细胞死亡[45-49]. Rudolph et al[50]研究认为肝纤维化进程中端粒长度逐渐缩短, 是影响肝细胞再生并加重肝纤维化程度的主要因素之一. 该学者将腺病毒介导的大鼠端粒酶模板RNA基因, 经尾静脉注射导入肝纤维化大鼠肝脏, 发现可恢复肝细胞端粒酶活性和端粒长度, 促进肝细胞再生, 抑制TGF-β1表达, 显著减轻纤维化程度, 肝纤维化进程和肝功能衰竭得到明显抑制. 利用端粒酶进行基因治疗研究的不断深入有望为慢性肝病或其他终末期肝功能衰竭提供更有效的手段[51,52].
肝细胞移植是恢复肝细胞功能、减轻肝纤维化发展的极有前途的治疗方法之一, 目前主要的问题是供体肝细胞短缺、体外不易培养以及移植后免疫排斥反应[53,54]. 晚近研究表明: 通过构建带有减轻免疫源性和促进肝细胞增生的重组腺病毒, 可明显提高肝细胞移植的治疗效果. Okada et al[55]构建了CMV启动子驱动的IL-10重组腺病毒AdCMVvIL-10, 体外感染异源供体肝细胞后, 移植注射于脾脏, 异体免疫排斥反应受到抑制, 供体肝细胞的存活期明显延长, 接近自体肝细胞移植的效果.
促进移植肝细胞在受体肝脏内增生是提高肝细胞移植水平的重要途径. 一些研究认为, 供体肝细胞进入受体肝脏生长增生的数目一般不超过0.5%, 主要原因可能是受体肝脏内缺乏移植肝细胞增生的刺激因素[56-59]. Vrancken et al[60]将构建成的非分泌型的uPA重组腺病毒Ad. PGK-muPA以5×109 pfu效价经门静脉注射入待移植小鼠, 2 d后行肝细胞移植, 结果发现供体肝细胞在Ad. PGK-muPA注射组增生的数目是对照组的20倍. 引起肝细胞增生的原因最初认为是由于外源表达的uPA可将肝细胞内的纤溶酶原转变为纤溶酶, 继而产生许多活性蛋白, 对受体肝细胞产生毒性作用, 产生了促进肝细胞生长的刺激因素, 从而诱发移植肝细胞的增生. 此外uPA可将单链无活性的HGF转变为具有活性的双链成分, 进一步促进肝细胞生长. 晚近, 许多学者深入探讨了肝细胞再生的机制, 认为外源导入促进细胞增生的基因可明显提高移植肝细胞的功能和存活时间, 提高肝细胞移植的治疗效果[61-63].
鉴于腺病毒载体在肝纤维化基因治疗中的广泛应用, 许多学者对其疗效和安全性进行了充分评估[64-66]. Connelly [67]认为将携带外源基因的重组复制缺陷型腺病毒直接导入肝细胞是进行基因治疗很有前途的方法, 许多体内实验均证明腺病毒治疗的高效性; 但瞬时导入重组腺病毒, 外源基因持续表达不超过1 mo, 同时腺病毒载体的免疫原性和肝脏毒性也是需要解决的问题. 一些学者认为重组腺病毒进入血液循环后, 主要集中于肝脏表达, 可引起肝脏的急性损伤, 但仅仅是一种非特异性免疫反应, 多由中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞的激活和一些趋化因子的释放所致. Nakatani et al[68]进一步研究评价了重组腺病毒基因治疗肝硬化的疗效和安全性. 静脉注射仅表达lacZ的重组腺病毒4 d后, 发现lacZ基因在肝硬化小鼠肝细胞中的表达是正常小鼠的2.5倍; 血清肝功能指标升高不明显; 组织病理学仅在正常小鼠肝脏中出现轻型肝炎的病理变化(肝细胞增生和炎细胞浸润), 肝硬化小鼠未出现新的明显的病理改变; 各种免疫学指标亦未有显著变化, 动物实验证实严重肝病利用腺病毒载体静脉注射进行基因治疗是安全有效的.
总之, 近年来肝纤维化治疗已取得很大的进展, 分子生物学技术的飞速发展为肝纤维化的基因治疗提供了新的思路[69-71]. 围绕抑制ECM生成、增加ECM降解和促进肝细胞再生等方面构建相应的重组复制缺陷型腺病毒在体外和动物实验中显示出较好的治疗效果. 随着基因工程、细胞因子生物学和基质生物学等研究的不断深入, 将会进一步发现和构建更多低毒、高效、简易的载体系统, 为肝纤维化治疗带来新的希望.
编辑: N/A
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