修回日期: 2002-08-15
接受日期: 2002-08-23
在线出版日期: 2003-03-15
目的: 探讨MUC5AC, MUC6核粘蛋白合成肽在诱导小鼠抗肿瘤免疫反应中的作用.
方法: 采用动物实验方法观察MUC5AC和MUC6黏核蛋白的合成肽诱导小鼠的细胞和体液免疫反应及其淋巴细胞体外抗肿瘤作用.
结果: MUC5AC, MUC6合成肽可诱导小鼠产生相应的抗体及迟发型过敏反应, 但不能产生脾淋巴细胞的明显增生及体外抗7901胃癌细胞株的作用.
结论: MUC5AC, MUC6合成肽免疫小鼠可引发体液及细胞免疫反应, 但尚不足以产生淋巴细胞毒作用.
引文著录: 汪荣泉, 房殿春, 刘为纹. MUC5AC、MUC6核粘蛋白合成肽诱导小鼠抗肿瘤免疫反应. 世界华人消化杂志 2003; 11(3): 314-317
Revised: August 15, 2002
Accepted: August 23, 2002
Published online: March 15, 2003
AIM: To evaluate the immune response and anti-tumor activity induced by synthetic polypeptides of MUC5AC and MUC6 apomucins in mice.
METHODS: The cellular and humoral immunity induced by MUC5AC and MUC6 synthetic polypeptides were examined in mouse, proliferation of lymphocyte and cytotoxicity of T lymphocytes were assessed by 3H-TDR incorporation assay.
RESULTS: The conjugated MUC5AC and MUC6 synthetic polypeptides could induce B cells in mice to produce high titre antibodies against the immunized peptides and delayed-type hypersensitivity. But they could not induce significant proliferation of lymphocyte and specific cytotoxic T-lymphocytes (CTL) in vitro against 7901 gastric cancer cells. This may be caused by the experimental design, inefficient epitope of synthetic polypeptides, or MHC restriction.
CONCLUSION: MUC5AC-KLH and MUC6-KLH synthetic polypeptide conjugates can induce cellular and humoral immunity other than cytotoxic T lymphocytes of anti-tumor effect.
- Citation: Wang RQ, Fang DC, Liu WW. Anti-tumor immunity in mice induced by synthetic polypeptides of MUC5AC and MUC6 apomucins. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2003; 11(3): 314-317
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v11/i3/314.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v11.i3.314
粘蛋白表达于多种人类正常腺上皮组织及部分腺癌, 其分子结构是近年来研究的热点. 目前已克隆出至少17种人粘蛋白基因及其他动物的类似物(MUC1-17), 其中以MUC1-MUC6研究最为深入[1-5]. MUC1核粘蛋白及其糖链成份, 甚至MUC1的DNA疫苗已提示具有诱发机体的细胞免疫和体液免疫作用, 部分基于MUC1分子所设计的黏液瘤苗已进入了临床Ⅰ、Ⅱ期验证, 有的已用于临床[6-8]. 国内马运国研究提示, MUC2、MUC3核粘蛋白可诱发抗肿瘤细胞免疫[9]. 其中的MUC2与MUC1和MUC3不同, 他却是一种分泌型粘蛋白分子, 由于其可能具有诱发机体抗肿瘤细胞免疫的作用, 这也促使我们对其他的分泌型粘蛋白分子MUC5AC、MUC6进行研究. MUC5AC、MUC6编码的核粘蛋白在正常细胞内是被高度糖基化后才被分泌出细胞外, 所以很少暴露于免疫系统, 肿瘤细胞内MUC5AC、MUC6的编码产物由于他们的不完全糖基化, 使核粘蛋白的表位易于暴露, 从而可能激发机体的抗肿瘤免疫反应[8,9]. 为了进一步明确粘蛋白介导的杀伤肿瘤细胞作用, 及其诱发免疫反应的有效肽成份, 本研究以体外合成的MUC5AC、MUC6粘蛋白合成肽免疫小鼠, 以证实其是否具有与MUC1, MUC2、MUC3相似的诱发小鼠抗肿瘤免疫反应, 藉以探索新的黏液瘤苗用于胃癌的治疗.
MUC5AC粘蛋白核心肽TTSTTSAPTTS, MUC6粘蛋白核心肽SFQTTTTYPTPSHPQTTLP, 皆由巴塞罗那自动化大学临床医学研究所de Bolos Carme博士惠赠. 合成肽用ABI430A合成仪经固相方法合成, 粗肽经高效液相色谱法测定其纯度超过80%, 再进一步以反向固相色谱法纯化均匀的产物, 最后经氨基酸分析和电子喷雾物质光谱鉴定合成肽氨基酸序列的正确性[10]. 6-8周龄Balb/c小鼠(47只)购自第三军医大学动物饲养中心, 随机分成11组, 每组3-5只, 雌雄搭配. 福氏佐剂和福氏不完全佐剂按常规方法自制, 其中的液体石蜡油、羊毛脂由本院药房提供, 而结核杆菌疫苗由重庆市沙坪坝区小龙坎防疫站惠赠. 胰蛋白酶, KLH购自Sigma公司, 3H-TDR购自中国原子能研究所, RPMI 1640购自Gebco公司, 重组人IL-2购自第三军医大学免疫学教研室.
MUC5AC、MUC6合成肽与KLH的连接按戊二醛连接法进行. MUC5AC, MUC6合成肽溶于去离子水, MUC5AC合成肽中(2.9 mg)加入去离子水(1.45 mL), MUC6合成肽(4.4 mg)中加入去离子水(2.2 mL). 连接反应: MUC5AC合成肽1.45 mg(0.725 mL)加入KLH 1.45 mg和3g/L戊二醛0.3 mL组成反应液(1.17 mL). MUC6合成肽2.2 mg(1.1 mL)加入KLH 2.2 mg和3g/L戊二醛0.44 mL组成反应液(1.76 mL). 反应液经室温下搅拌反应2 h, 加入1 mol/L甘氨酸0.25 mL阻断未反应的戊二醛. MUC5AC-KLH, MUC6-KLH用PBS液透析过夜后, 分别获得相对纯化的MUC5AC-KLH和MUC6-KLH. 实验动物分11组, 皮下注射免疫源. 组1(5只): MUC5AC-KLH(10 μg)加佐剂0.25 mL; 组2(3只): MUC5AC-KLH(20 μg)加佐剂0.25 mL; 组3(3只): MUC5AC-KLH(30 μg)加佐剂0.25 mL; 组4(5只): MUC6-KLH(10 μg)加佐剂0.25 mL; 组5(3只): MUC6-KLH(20 μg)加佐剂0.25 mL; 组6(3只): MUC6-KLH(30 μg)加佐剂0.25 mL; 组7(5只): MUC5AC(10 μg); 组8(5只): MUC6(10 μg); 组9(5只): KLH(10 μg); 组10(5只): 佐剂0.25 mL; 组11(5只): 生理盐水0.25 mL. 第1次免疫时应用完全福氏佐剂, 2 wk后第2次免疫, 应用不完全福氏佐剂, 2 wk后再免疫第3次, 以后隔1 wk免疫1次, 共3次, 每次均用不完全福氏佐剂. 最后1次免疫后1 wk按要求安乐处死小鼠, 收集小鼠血清作ELISA以检测抗MUC5AC和 MUC6合成肽的抗体, 取小鼠脾脏并分离其淋巴细胞, 测定淋巴细胞增生试验及其肿瘤细胞杀伤活性试验.
1.2.1 血清学试验: 血清中抗MUC5AC, MUC6合成肽抗体的检测采用EILISA法. MUC5AC, MUC6合成肽(10 μg/孔)包被在酶联板上, 系列稀释的血清与包被的抗原孵育过夜, 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG二抗(购自北京中山公司)室温孵育3 h, 每孔加入底物(H2O2和OPD)(300 μL)反应. 以上各步之间均采用PBS-Tween20缓冲液冲洗各孔3次, 每次3 min. 每孔加入3 mol/L NaOH(50 mL)终止反应, 测定波长449 mm处各孔的吸光度A.
1.2.2 T淋巴细胞试验: 第2次免疫后10 d行迟发型皮肤过敏试验, 在小鼠的脚掌内平均注射抗原8 μg(溶于PBS内), 24 h和48 h后用游标卡尺测量各只经注射处的小鼠脚掌厚度. 末次免疫1wk后按要求安乐处死小鼠并无菌取脾, 分离单个核细胞, 体外培养于RPMI 1640培养液(含100 mL/L小牛血清蛋白), 其中含MUC5AC和MUC6合成肽(5 mg/L)和γ-hIL-2 100 mg/L, 并以2×105个细胞/孔 加入96孔培养板上, 在37℃和50 mL/L C02条件下孵育3 d, 加入18.5 kBq/L [3H]-TDR 18 h后, 用多头细胞收集仪收集细胞于49型玻璃纤维滤纸上, 60℃烘干, 膜片置闪烁杯中, 每杯中加闪烁液4 mL. 液闪仪测各管的Bq值.
1.2.3 细胞毒测定: 取对数生长期的胃癌细胞株7901, 调成1×109/L浓度, 加入3H-TDR740 kBq/L, 置37℃水浴中温育4 h, 每隔15 min振荡1次, 离心洗涤3次, 配成所需浓度待用. 效应细胞杀伤活性的测定采用3H-TDR释放法微量细胞毒试验进行检测, 3H-TDR标记的靶细胞配成1×109/L浓度, 待测效应细胞样本配成5×106/mL, 于96孔平底培养板中每孔加靶细胞及待测效应细胞各0.1 ml, 此为实验组; 自然释放组不加效应细胞, 用RPMI 1640培养液0.1 mL代替, 每组设3个复孔, 置饱和湿度、37℃、50 mL/L C02孵箱中培养4 h, 于培养终止前30 min每孔加2% 胰酶10 μL, 消化30 min, 用冷Hanks液50 μL/ 孔终止消化. 经多头细胞收集器将样品收集于49型玻璃纤维滤纸上. 60℃烘干, 膜片置闪烁杯中, 每杯中加闪烁液4 mL, 液闪仪测各管Bq值. 效应细胞的杀伤活性用细胞毒指数(CI)表示. CI% = 1-(实验组Bq值-本底Bq值÷自然释放组Bq值-本底Bq值)×100%. 效应细胞培养上清杀伤活性的测定, 靶细胞的标记同前, 收获培养一定时间的效应细胞(淋巴细胞)培养上清分别加入到含3H-TDR标记靶细胞的96孔培养板内, 0.1 mL/孔, 每组设3个复孔, 置饱和湿度, 在50mL/L C02孵箱中于37℃条件下培养16-18 h, 多头细胞收集器收集细胞, 用液闪仪测定残留靶细胞的3H-TDR掺入量. 阴性对照组加标记的靶细胞O. 1 mL/孔, 以RPMI 1640培养液代替效应细胞上清. 杀伤活性(%) = 1-(实验组Bq÷阴性对照Bq)×100%. 胃癌细胞株7901, Kato-3中粘蛋白MUCl, MUC2, MUC3, MUC5AC, MUG6核粘蛋白的表达采用免疫组化方法, 方法同前[11,12].
统计学处理 所得数据用t检验, P<0.05为相差显著; P<0.01为相差非常显著.
胃癌细胞株7901细胞中MUC5AC, MUC6核粘蛋白表达为强阳性或中等度阳性, 故下列实验采用7901细胞株为细胞毒试验的靶细胞.
经ELISA法检测免疫后小鼠血清中抗MUC5AC, 抗MUC6合成肽的抗体, 结果免疫原为单纯佐剂、单纯KLH和生理盐水的小鼠无抗MUC5AC, 抗MUC6合成肽的抗体产生; 免疫原为单纯10 μg的MUC5AC, MUC6合成肽(连接型), 20 μg, 30 μg的MUC5AC, 和20 μg, 30 μg的MUC6合成肽(非连接型)的小鼠均产生了相应的抗MUC5AC, 抗MUC6合成肽的抗体. 这说明MUC5AC、MUC6的连接型和非连接型均能诱导小鼠的体液免疫反应并产生其相应的抗体.
经刺激原刺激后24 h和48 h测定小鼠脚掌厚度, MUC5AC, MUC6合成肽与KLH的连接型小鼠的脚掌厚度较MUC5AC, MUC6合成肽的非连接型组、单纯KLH组、单纯生理盐水组和单纯佐剂组明显厚, 这说明MUC5AC, MUC6合成肽与KLH的连接型加佐剂免疫小鼠后产生了皮肤迟发型过敏反应. 而单纯MUC5AC, 单纯KLH和单纯佐剂均不能产生皮肤迟发型过敏反应, 单纯MUC6合成肽则可能产生皮肤迟发型过敏反应. 由于皮肤迟发型皮肤过敏反应是细胞免疫反应的表现形式, 故MUC5AC, MUC6合成肽与KLH的连接型加佐剂可以诱导小鼠的细胞免疫反应(表1).
MUC5AC, MUC6合成肽的连接型与佐剂组和单纯合成肽、生理盐水和单纯佐剂组相比, 他们淋巴细胞的3H-TDR标记率无差别, 而3H-TDR标记率(Bq)反映了培养中的淋巴细胞的增生反应能力, 这提示我们, 尽管MUC5AC, MUC6合成肽的连接型可以诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫反应, 但我们所设计的实验并没有发现其免疫小鼠的淋巴细胞增生率较其他组高, 具体的原因目前并不清楚, 可能与所用的佐剂或使用免疫原的量较少有关. 所以我们分别用10, 20, 30 μg的MUC5AC, MUC6合成肽的连接型与佐剂免疫不同的小鼠, 并在同一条件下测定各小鼠脾淋巴细胞的3H-TDR标记率, 结果30 μg组较10, 20 μg组有增高的趋势, 但经统计学分析他们之间并没有显著差别(P>0.05), 进而提示小鼠淋巴细胞的增生率与MUC5AC, MUC6合成肽的连接型抗原加入量之间可能无关.
MUC5AC, MUC6合成肽的连接型与佐剂组和单纯合成肽、生理盐水和单纯佐剂组相比, 小鼠脾细胞及其培养上清在体外对胃癌细胞株7901无明显的杀伤作用. 这提示MUC5AC, MUC6合成肽的连接型虽然可以一定程度上诱导机体的体液免疫和细胞免疫应答, 但我们设计的MUC5AC, MUC6合成肽尚不足以诱导小鼠的抗肿瘤免疫反应. 将来使用其他不同的MUC5AC, MUC6合成肽分子的实验及实验方法的改进是需要的.
一些人类肿瘤抗原已被证明可诱发机体的细胞免疫和体液免疫反应, 而细胞免疫在抑制肿瘤生长中起重要作用.
本研究证明, MUC5AC, MUC6合成肽与KLH的连接型加用福氏佐剂不仅可以诱发小鼠的体液免疫, 还可诱发细胞免疫反应, 但不能诱导小鼠淋巴细胞在体外的增生反应, 因而不能使小鼠淋巴细胞或其培养上清产生体外杀伤肿瘤细胞活性, 而单纯应用MUC6, MUC5AC合成肽组小鼠不能产生皮肤迟发性过敏反应, 这说明KLH和佐剂在诱发细胞免疫中起了很重要的作用, 可能是起加强抗原提呈的作用. 粘蛋白在癌变时可发生质和量的改变, 出现新的抗原表位. 由于MUCl是最先与机体免疫系统接触的细胞表面分子之一, 且含有许多连续重复序列, 可作为一种抗原使T细胞的TCR交联, 从而不需要MHC的参与就可活化细胞毒淋巴细胞(CTL), 即他对CTL的活化是非MHC限制性的. 因此MUC1是肿瘤主动特异性免疫治疗理想的靶分子[6-8]. 目前已设计了多种基于MUCl的免疫原, 如表达MUCl的细胞、从癌细胞中纯化的MUCl、重组核心蛋白、转染细胞产生的MUCl糖型、含有连续重复序列的肽或糖肽, 表达MUCl cDNA的重组病毒, 合成的糖链疫苗、MUCl核酸疫苗、抗MUC1抗体, 作为一种新的黏液瘤苗用于肿瘤治疗的研究, 其中含连续重复序列的肽, 合成的糖链疫苗和抗MUCl抗体己应用于临床, 并取得了一定的结果[11].
属于粘蛋白家族的MUC2, MUC3, MUC4, MUC5和MUC6粘蛋白同样在肿瘤中是不完全糖基化的, 而正常组织是高度糖基化的, 并且MUC2, MUC5和MUC6这些粘蛋白与MUCl粘蛋白不同, 他们不存在细胞表面, 而是以分泌型粘蛋白存在于人体的一些腔道内, 几无可能暴露于免疫系统. 所以进一步研究这些粘蛋白前体是否可诱发抗肿瘤的免疫反应, 对探索一些新的粘蛋白瘤苗具有潜在的价值. 国内袁玫et al[9]研究提示, MUC2和MUC3可能诱发细胞免疫, 证据主要是(1)核心肽加Detox免疫小鼠后, 皮内注射MUC2或MUC3都可诱发皮肤迟发过敏反应; (2)抗MUC2及MUC3的抗体都可不同程度地阻断核心肽的免疫小鼠的淋巴细胞毒作用. 而我们用MUC5AC, MUC6合成肽免疫小鼠引发了体液和细胞免疫反应, 但尚不足以产生淋巴细胞毒作用, 究其原因, 可能与 (1)所使用的佐剂是福氏佐剂, 这种佐剂主要引起体液免疫反应, 这被我们的ELISA检测结果证实, 细胞免疫很弱, 而马运国及其他的报道所采用的佐剂为专门诱发细胞免疫反应为主的佐剂, 如Detox和QS-21[12]; (2)采用检测细胞毒的方法, 51Cr释放法可能比3H-TDR释放法更敏感. 所以进一步改进实验的设计方法进行研究还是需要的. 此外合成肽的连接型(与KIH相连)能产生高滴度的抗体, 这对于设计合成新的黏液瘤苗是必须的; (3) de Bolos所设计的合成肽主要目的是制备其相应的检测抗体, 可能在诱导细胞免疫方面的作用较弱, 所以进一步使用不同合成肽分子的实验是必须的.
编辑: N/A
| 1. | Hanisch FG, Müller S. MUC1: the polymorphic appearance of a human mucin. Glycobiology. 2000;10:439-449. [PubMed] [DOI] |
| 2. | Velcich A, Yang W, Heyer J, Fragale A, Nicholas C, Viani S, Kucherlapati R, Lipkin M, Yang K, Augenlicht L. Colorectal cancer in mice genetically deficient in the mucin Muc2. Science. 2002;295:1726-1729. [PubMed] [DOI] |
| 3. | Williams SJ, Wreschner DH, Tran M, Eyre HJ, Sutherland GR, McGuckin MA. Muc13, a novel human cell surface mucin expressed by epithelial and hemopoietic cells. J Biol Chem. 2001;276:18327-18336. [PubMed] [DOI] |
| 4. | Perrais M, Pigny P, Buisine MP, Porchet N, Aubert JP, Van Seuningen-Lempire I. Aberrant expression of human mucin gene MUC5B in gastric carcinoma and cancer cells. Identification and regulation of a distal promoter. J Biol Chem. 2001;276:15386-15396. [PubMed] [DOI] |
| 5. | Gum JR Jr, Crawley SC, Hicks JW, Szymkowski DE, Kim YS. MUC17, a novel membrane-tethered mucin. Biochem Biophys Res Commun. 2002;291:466-475. [PubMed] [DOI] |
| 6. | Zhang S, Graeber LA, Helling F, Ragupathi G, Adluri S, Lloyd KO, Livingston PO. Augmenting the immunogenicity of synthetic MUC1 peptide vaccines in mice. Cancer Res. 1996;56:3315-3319. [PubMed] |
| 7. | Graham RA, Burchell JM, Beverley P, Taylor-Papadimitriou J. Intramuscular immunisation with MUC1 cDNA can protect C57 mice challenged with MUC1-expressing syngeneic mouse tumour cells. Int J Cancer. 1996;65:664-670. [PubMed] [DOI] |
| 8. | Balloul JM, Acres RB, Geist M, Dott K, Stefani L, Schmitt D, Drillien R, Spehner D, McKenzie I, Xing PX. Recombinant MUC 1 vaccinia virus: a potential vector for immunotherapy of breast cancer. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 1994;40 Suppl 1:49-59. [PubMed] |
| 10. | De Bolós C, Garrido M, Real FX. MUC6 apomucin shows a distinct normal tissue distribution that correlates with Lewis antigen expression in the human stomach. Gastroenterology. 1995;109:723-734. [PubMed] [DOI] |
| 11. | Kontani K, Taguchi O, Ozaki Y, Hanaoka J, Tezuka N, Sawai S, Inoue S, Fujino S, Maeda T, Itoh Y. Novel vaccination protocol consisting of injecting MUC1 DNA and nonprimed dendritic cells at the same region greatly enhanced MUC1-specific antitumor immunity in a murine model. Cancer Gene Ther. 2002;9:330-337. [PubMed] [DOI] |
| 12. | Mitchell MS. Cancer vaccines, a critical review--Part II. Curr Opin Investig Drugs. 2002;3:150-158. [PubMed] |