大肠癌 Open Access
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世界华人消化杂志. 2003-03-15; 11(3): 302-305
在线出版日期: 2003-03-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i3.302
大肠癌组织微卫星不稳与hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化状态
房殿春, 杨仕明, 杨建民, 刘海峰, 彭贵勇, 肖天利, 汪荣泉, 刘为纹
房殿春, 杨仕明, 杨建民, 刘海峰, 彭贵勇, 肖天利, 汪荣泉, 刘为纹, 中国人民解放军第三军医大学西南医院全军消化专科中心 重庆市 400038
房殿春, 男, 1951年生, 吉林省长春市人, 汉族, 1989年第三军医大学博士研究生毕业. 现为第三军医大学西南医院全军消化科中心主任. 教授、主任医师、博士生导师、中华医学会消化病学会常委, 中华医学会消化内镜学会常委.
通讯作者: 房殿春, 400038, 重庆市, 中国人民解放军第三军医大学西南医院全军消化专科中心. fangdianchun@hotmail.com
电话: 023-6875424 传真: 023-8754124
收稿日期: 2002-07-31
修回日期: 2002-08-10
接受日期: 2002-08-16
在线出版日期: 2003-03-15

目的: 探讨大肠癌组织微卫星DNA不稳与hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化状态的关系.

方法: 采用PCR为基础的方法检测微卫星DNA不稳; 采用甲基化特异性PCR方法检测hMLH1 和hMSH2基因启动子区的甲基化状态.

结果: 正常大肠黏膜未见hMLH1 和hMSH2基因启动子区的高甲基化. 76例大肠癌中检出hMLH1高甲基化8 例, 占10.5%, 而且均为去甲基化和高甲基化并存, 未见有hMSH2高甲基化者. 检出MSI 20例, 检出率为26.3%. 将MSI分为高频率MSI(MSI-H, ≥2个位点)10例、低频率MSI(MSI-L), 仅为1个位点10 例和MSI阴性(MSS)56 例三组, 结果右侧大肠癌hMLH1高甲基化检出率(23.1%)显著高于左侧大肠癌(4.0%, P<0.05). MSI-H组hMLH1高甲基化的检出率(8/10)显著高于MSI-L(2/10)和MSS组(6/56, P<0.01-0.001).

结论: hMLH1高甲基化与右侧大肠癌的发生有关, 可能参与了MSI病理途径, 而hMSH2甲基化状态可能与MSI途径无关.

关键词: N/A
引文著录: 房殿春, 杨仕明, 杨建民, 刘海峰, 彭贵勇, 肖天利, 汪荣泉, 刘为纹. 大肠癌组织微卫星不稳与hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化状态. 世界华人消化杂志 2003; 11(3): 302-305
Methylation of hMLH1 and hMSH2 promoter in colorectal cancer with microsatellite instability
Dian-Chun Fang, Shi-Ming Yang, Jian-Min Yang, Hai-Feng Liu, Gui-Yong Peng, Tian-Li Xiao, Rong-Quan Wang, Wei-Wen Liu
Dian-Chun Fang, Shi-Ming Yang, Jian-Min Yang, Hai-Feng Liu, Gui-Yong Peng, Tian-Li Xiao, Rong-Quan Wang, Wei-Wen Liu, Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Correspondence to: Dian-Chun Fang, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China. fangdianchun@hotmail.com
Received: July 31, 2002
Revised: August 10, 2002
Accepted: August 16, 2002
Published online: March 15, 2003

AIM: To explore methylation of hMLH1 and hMSH2 promoter with microsatellite instability (MSI) in colorectal carcinomas.

METHODS: Methylation of hMLH1 and hMSH2 promoter was measured with methylation-specific PCR; MSI was analyzed by PCR-based methods.

RESULTS: No methylation of hMLH1 and hMSH2 promoter was found in 10 normal colorectal mucosas. Seventy-six cases of sporadic colorectal carcinoma were studied for methylation of hMLH1 and hMSH2 promoter and MSI. Methylation of hMLH1 promoter was detected in 8 (10.5%)colorectal carcinomas and none in hMSH2. Frequence of hMLH1 methylation on right-sided colorectal cancer (23.1%)was significantly higher than that on left one (4.0%, P < 0.05). MSI was detected in at least one locus in 26.3%(20/76) of the tumors analyzed with five microsatellite markers. Frequence of hMLH1 methylation in gastric cancer with MSI-H (80.0%)was significantly higher than that in gastric cancer with MSI-L (20.0%, P < 0.01) and with MSS (10.7%, P < 0.001).

CONCLUSION: Methylation of hMLH1 promoter is related to right-sided colorectal cancer and involved in the MSI pathway.

Key Words: N/A
0 引言

基因不稳在肿瘤的发生中起重要作用. 这种基因不稳可以表现为两种不同的形式, 亦即染色体不稳和微卫星不稳(MSI)[1-8]. 微卫星不稳是错配修复基因缺陷(MMR)的重要标记, 研究发现90%以上的遗传性非息肉性直结肠癌(HNPCC)可检出MSI, 且多伴有错配修复基因 hMLH1 和 hMSH2基因的种系突变, 而少有其他错配修复基因的突变[9-15]. 业已发现, 大肠癌发生过程中导致错配修复基因失活的另一方式为DNA甲基化的改变, 这种改变常伴有错配修复基因表达的丢失[16-18]. 为探讨大肠癌组织甲基化改变与微卫星不稳的关系, 我们进一步检测了大肠癌组织hMLH1 和hMSH2基因启动子区的甲基化状态.

1 材料和方法
1.1 材料

76例大肠癌及相应正常组织均为外科手术切除标本, 标本切除后立即置-80℃冻存备用. 每例组织行冰冻切片HE染色, 以确定肿瘤细胞的丰度. DNA提取采用蛋白酶K消化, 酚/氯仿提取法. 76例大肠癌中, 男48 例, 女28例, 年龄32-88(平均58.6)岁. 所有患者均无肿瘤家族史, 亦未接受过放疗和化疗.

1.2 方法

1.2.1 甲基化特异PCR(MSP): hMLH1和hMSH2基因CpG岛DNA甲基化类型参照文献采用甲基化特异性PCR (MSP)方法进行检测[19]. 用于hMLH1去甲基化反应的引物序列为5'-TTTTGA TGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT-3'(正义), 5'-ACCA CCTCATCATAACTACCCACA-3' (反义); 用于甲基化反应所用引物序列为5'-ACGTAG ACGTTTTATTAGGGTCGC-3'(正义); 5'-CCTCATCGTAACTACCCGCG-3' (反义); 用于hMSH2去甲基化反应的引物序列为5'-GGTTGTTGTGGTTGGATGTTGTTT -3'(正义), 5'-CAACTACAACATCTCCTTCA ACTACACCA-3'(反义); 用于甲基化反应所用的引物序列为5'-TCGTGGTCGGACGTCG TTC-3'(正义), CAACGTCTCCTTCGACTACACCG-3' (反义). MSP的检测步骤、PCR的反应条件和电泳方法见文献[8].

1.2.2 微卫星不稳(MSI)的检测: 包括5个微卫星位点: BAT25, BAT26, BAT40, D2S123, 和D5S346. 检测方法、步骤见前文[1]. 与正常组织相比, 若肿瘤组织出现泳动的条带即判断为MSI. 根据每例肿瘤组织突变型微卫星位点的多少, 将其分为高频率MSI(MSI-H, ≥2个位点)、低频率MSI(MSI-L, 仅为1个位点)和MSI阴性(MSS)3组(图1).

图1
图1 大肠癌微卫星不稳定性检测结果. N: 正常组织; T: 肿瘤组织.

统计学处理 采用x2检验, P<0.05为有显著差别.

2 结果
2.1 大肠癌hMLH1甲基化状态

为检测hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化状态, 我们采用甲基化特异性PCR检测了hMLH1 和hMSH2基因5' CpG甲基化状态. 所扩增的hMLH1 区域为CpG 岛最密集区域[19]. 正常大肠黏膜未见hMLH1 和hMSH2启动子区甲基化现象, 76 例大肠癌中发现高甲基化8例, 占10.5%, 而且均为去甲基化和高甲基化并存(图1). 68例大肠癌均有hMSH2基因 5' CpG岛去甲基化, 未发现有甲基化现象. hMLH1甲基化与临床病理参数的关系见表1.由表1可见, 右侧大肠癌甲基化的检出率显著高于左侧大肠癌(P<0.05). 76例大肠癌中至少有1 个位点检出MSI者 20 例(26.3%), 右侧大肠癌MSI的检出率显著高于左侧大肠癌(P<0.05, 表1).

表1 hMLH1突变和MSI与临床病理参数的关系.
病理参数nMLH1甲基化(%)MSI(%)
肿瘤大小 <5 cm485(10.4)12(25.0)
>5 cm283(10.7)8(28.6)
肿瘤部位 右侧266(23.1)a11(42.3)a
左侧502(4.0)9(18.0)
分化程度 高222(9.1)6(27.3)
中344(11.8)8(23.5)
低121(8.3)4(33.3)
黏液腺癌81(12.5)2(25.0)
浆膜浸润 无424(9.5)12(28.6)
有344(11.8)8(23.5)
淋巴结转移 无435(11.7)11(25.6)
有333(9.1)9(27.3)
临床分期 Ⅰ、Ⅱ期464(8.7)12(26.1)
Ⅲ 、Ⅳ期384(10.5)8(17.4)
aP<0.05 vs 左侧大肠癌.
2.2 hMLH1甲基化与MSI状态的关系

根据MSI检出位点的多少, 将76例大肠癌中分为MSI-H 10 例(13.2%)、MSI-L 10例(13.2%)、MSS 56例(73.7%). 10例MSI-H组中有8例为hMLH1启动子区高甲基化, 与MSI-L组(2/10)和MSS组(6/56)相比差别非常显著(P<0.01-0.001), 而MSI-L与MSS组相比差别则无显著意义(P＞0.05).

3 讨论

我们采用甲基化特异PCR检测了大肠癌组织hMLH1和hMSH2的甲基化状态, 76例大肠癌检出hMLH1高甲基化10例, 检出率为10.5%, hMSH2未发现有高甲基化者, 此结果与文献[20-22]报告的检测结果相一致. 文献报告MSI-H 胃癌与hMLH1启动子区高甲基化有关, 而与hMLH1基因突变无关[23]; 还有文献报告, MSI-L胃癌虽然在临床表型方面与MSI-H胃癌有明显不同, 但在hMLH1甲基化改变方面具有与MSI-H胃癌相似的特点[24]. 从本文大肠癌资料来看, 10例MSI-H大肠癌中有8例(80.0%)表现为hMLH1启动子区的高甲基化, 提示hMLH1启动子区高甲基化与MSI-H大肠癌密切相关. 但MSI-H大肠癌高甲基化的检出率显著高于MSI-L和MSS大肠癌, 而MSI-L大肠癌hMLH1启动子区高甲基化的检出率与MSS大肠癌相比无显著差异, 提示MSI-H 大肠癌在hMLH1启动子区高甲基化方面与MSI-L和MSS大肠癌有明显不同, 而MSI-L大肠癌可能涉及到一条与MSS大肠癌相似的分子途径, 此与我们对不同MSI状态胃癌发生分子途径的研究结果相一致[25-28].

现已明确大肠癌可分为高频率MSI(MSI-H), 低频率MSI(MSI-L)和无MSI(MSS)3种类型, 不同MSI类型大肠癌临床病理特点也不尽相同. Hawkins et al[21]检测426例散发性大肠癌CpG岛甲基化状态, 发现CpG岛甲基化与右侧大肠癌、女性、老年患者、高分化或黏液性肿瘤、肿瘤组织有较多淋巴细胞浸润、野生型p53和K-ras突变、微卫星不稳有关, 预后较好. 本研究发现呈高甲基化状态大肠癌多以右侧多见, 与文献[29-31]报告的结果一致. 但未发现hMLH1基因甲基化状态与组织学类型、肿瘤浸润深度、有无淋巴结转移和临床病理分期有明确相关关系, 提示大肠癌hMLH1甲基化状态对预测患者预后的价值有限. 有作者检测MSI+大肠癌细胞株hMLH1的甲基化状态发现, 肿瘤细胞均表现为高甲基化类型, 而无去甲基化现象[32], 而本文原发MSI+大肠癌却表现为hMLH1启动子区的甲基化和去甲基化并存现象. 肿瘤组织中的非甲基化部分可能与原发肿瘤中存在非肿瘤细胞成分, 如间质细胞、炎细胞和血管细胞等有关, 这些细胞普遍存在原发肿瘤中, 而不存在于培养的细胞株中, 由此导致了肿瘤细胞株仅表现为高甲基化, 而大肠癌组织中却表现为高甲基化和去甲基化共存现象.

基因不稳在大肠癌的发生中起重要作用. 这种基因不稳可以分为二种不同的形式, 即染色体不稳和微卫星不稳. 前者包括MSS和MSI-L组的多数大肠癌, APC/MCC、DCC和p53抑癌基因的丢失在其发生发展中起重要作用; 而后者包括少数MSI-H大肠癌, 由于错配修复基因突变导致了广泛的MSI. 我们进一步分析了hMLH1和hMSH2 启动子区甲基化与两条病理途径的关系, 发现 hMLH1 启动子高甲基化通常发生在MSI-H大肠癌, 提示hMLH1 启动子高甲基化与微卫星不稳途径有关. 文献报告hMLH1 启动子区甲基化与hMLH1基因mRNA和蛋白表达的减少有关, 而hMLH1 启动子去甲基化可以导致肿瘤细胞hMLH1 蛋白的再表达, 进而恢复MMR 活性. 由于DNA甲基化状态可被逆转, 因此针对基因甲基化的靶向治疗已引起人们的重视. 通过恢复未发生突变或丢失, 而仅仅被抑制的生长调控基因的表达而恢复细胞正常生长调控功能, 从而可达到治疗的目的.

编辑: N/A

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