IRES特异性IRNA在丙型肝炎抗病毒治疗中作用

摘要

丙型肝炎基因治疗是目前研究的热点, HCV IRES是丙肝病毒核酸复制和蛋白翻译的关键结构. 目前针对IRES结构的治疗策略主要包括反义核酸、核酶、抑制性RNA等. 现就抑制性RNA在HCV感染基因治疗中作用研究进展作简要综述.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: October 25, 2004
Revised: November 2, 2004
Accepted: November 20, 2004
Published online: February 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

到目前为止, 抗HCV感染的治疗效果远不尽人意, 其重要原因之一是不能快速、有效地抑制HCV基因在宿主体内的表达, 并清除病毒[1-18]. 近年来一些学者提出了基因治疗的思路, 主要包括反义核酸策略、核酶策略、细胞内干扰性多肽或蛋白策略、抑制性RNA策略等, 后者具有高效、特异和安全等优点, 现就其研究进展综述如下.

1 HCV因结构及翻译机制

1.1 HCV基因结构

HCV是黄病毒属成员, 单股正链RNA病毒, 全长约9 400核苷酸(nt)组成, 含有-大的开放读码框(ORF), ORF几乎跨越HCV全基因组. HCV基因组5'末端为非编码区(NCR), 位于ORF上游. 3'末端也为NCR区, 位于ORF的下游, 可含poly (A)或poly(U)尾. 5'NCR和3'NCR在病毒的复制和稳定病毒的生物学性状等方面起重要作用[19-29]. 采用基因克隆方法可以检出HCV 5'NCR区的完整序列. 首先报道的从原型株获得的5'NCR长为341 nt, 以后报道的该区长短略有所不同, 为319nt或324 nt, 这些短的5'NCR可能是HCV基因组在体内被切割或基因变异的结果. 5'NCR在HCV基因组中最为保守. 在5'NCR中存在三个高度保守的结构区域, 分别位于3-65、178-199和246-263位, 后二个区域与病毒的进化有关, 前一个区域毗邻病毒蛋白前体翻译的真实启动子AUG, 故认为这-结构对HCV基因组的翻译至关重要, 这-假设在以后的体内外实验研究中得到了证实. 通过热力学模拟试验和使用特异性RNA酶裂解试验分析HCV 5'NCR二级结构证实: 5'NCR二级结构可分为4个结构域, 结构域I呈发夹状, 可能有阻止病毒翻译启动的作用; 结构域是一个大的茎-环结构, 可能存在-辅助结合位点, 当核糖体或其他未知因子与其结合后会对HCV 5'NCR空间结构起稳定作用, 从而消除结构域I的负性作用, 保证病毒蛋白前体的有效翻译; 结构域III和结构域IV对HCV RNA有效启动和5'NCR翻译调控至关重要[30-35].

1.2 HCV蛋白翻译机制

迄今为止, 真核细胞中mRNA翻译机制有二种不同的形式. 第一种为核糖体扫描机制, 该机制涉及核糖体40S亚单位和5'帽状结构结合, 然后核糖体从5'端向3'端扫描, 直至碰到合适的起始密码子AUG; 第二种机制为内部启动, 特定病毒和细胞mRNA在5'NCR含有-定的序列, 可以介导非帽状结构形成依赖性蛋白翻译机制, 这-序列已被定为IRES, 位于5'端下游约100 nt左右处, 主要介导核糖体与mRNA结合. 这种机制最早在小核糖核酸病毒属中发现. 进一步研究发现, 宿主细胞性蛋白多肽和具有-定二级结构的病毒5'NCR结合是这种机制的关键. 现已确定的蛋白多肽包括La自身抗体、聚嘧啶束蛋白(PTB)及核仁素等, 这些蛋白多肽与IRES结合可便于核糖体与mRNA结合. HCV 5'NCR结构与瘟病毒和微小RNA病毒相似, 在HCV 5'NCR存在同微小RNA病毒相似的富嘧啶区即IRES结构. Wang et al以CAT作为报道基因, 应用PCR技术构建了-系列HCV 5'NCR控制突变型表达载体, 体外翻译和细胞转染实验证明, HCV基因组的翻译机制为非帽状结构形成依赖性的, 且证明IRES结构的存在和完整性是HCV蛋白翻译正常进行的结构基础[36-52]. 以这种机制进行蛋白翻译的病毒还有脊髓灰质炎病毒(PV)、口蹄疫病毒、鸭乙型肝炎病毒等.

2 IRNA的结构

1992年Coward和Dasgupta在研究PV时, 发现酵母细胞的-段60 nt的片段对PV病毒的复制和表达具有较强的抑制作用, 被称为抑制性RNA(IRNA). IRNA为一种核酸物质, 其-级结构和空间结构对其活性均有重要意义. Das et al采用缺失突变方法获得不同IRNA突变体(mutant IRNA, mIRNA), 并以mIRNA对含PV IRES的p2CAT体内外表达的抑制作用进行了检测. 结果缺失31-45 nt的mIRNA完全失去了抑制活性, 含30-40 nt的mIRNA保留了大部分的抑制活性, 而另一含30-45 nt的mIRNA表现出较高的体内抑制活性, 这说明序列30-40 nt是维持IRNA活性的必须序列. 此后, Venkatesan et al[53]依据能量级最低原则, 应用计算机软件MFOLD预测了IRNA及其互补体(complate IRNA, cIRNA)的二级结构, 发现二者具有大体相似的结构, 即二个环、一个茎和一个大的膨出. 为了证实此结果和确立其结构, 作者应用酶学方法和化学修饰法对IRNA及cIRNA二级结构进行了探索. 具体的方法是: 第1步以RNasesT1、核酸酶S1和RNases ONE消化体外转录的IRNA, 确立单链部分, RNasesV1消化IRNA, 确立双链部分; 第2步在先行与寡核苷酸杂交后用RNases H切割; 第3步应用DMS化学法改变腺苷和胞苷. 结果发现IRNA结构为: 20-27 nt与62-69 nt配对形成-茎, 二个环位于6-15 nt、36-43 nt, 膨出位于46-61 nt之间. cIRNA结构为二个位于20-28 nt和49-57 nt的环, 位于42-48 nt的茎和位于61-64 nt间的2 nt大小的膨出. 他们还证实IRNA和cIRNA结合相同的蛋白多肽, 具有相似的抑制活性, 上述结果提示二级结构对IRNA的抑制活性具有重要的意义. 他们进一步依据能量级最低化原则建立了m1IRNA和m2IRNA, 前者将44-46 nt 5'GCA 3'变为5'UUC 3', 结果是位于36 nt和43 nt间的发夹样环状结构消失了, 使m1IRNA与IRNA结构相比发生了改变. m2IRNA是通过将24-26 nt的碱基与63-65 nt的碱基互换而成, 结构与IRNA大相径庭. 对上述二种突变体活性检测的结果表明, 其完全失去了抑制活性, 这反过来进一步证明维持IRNA的二级结构对其活性是十分重要的. 总之, IRNA为-60 nt的小分子RNA, 可特异性抑制IRES介导蛋白翻译, 其二级结构是维持其抑制活性的关键.

3 IRNA的功能

3.1 IRNA抑制IRES介导蛋白翻译机制

据目前的研究结果分析, IRNA可特异性抑制IRES介导蛋白翻译. 从理论上推测IRNA作用机制有二种可能: (1)作为反义核酸与5'NCR特定序列结合; (2)与IRES介导蛋白翻译过程中宿主因子结合而阻断核糖体与IRES结合[54-61]. 目前的研究结果均不支持前一种情况, 其原因是: 早在分离提纯IRNA的过程中就见纯化的IRNA序列与病毒5'NCR序列无互补性, 且也不与其相杂交. 另外, 过量的Hela细胞裂解液可逆转IRNA抑制活性, 而过量的病毒RNA或5'NCR却无此作用, 这进一步说明IRNA并非通过与病毒直接作用而发挥抑制活性. 研究者们为了探讨IRNA作用机制, 而在纯化、克隆IRNA的基础上使用竞争性实验、UV-交叉连接实验等方法进行研究发现, Hela细胞裂解液中蛋白多肽P52与PV 5'NCR特异性环状结构相结合, IRNA可竞争性阻断这种结合, 经对IRNA二级结构与病毒5'NCR二级结构相比发现二者具有相似的环状结构, 这-发现证实IRNA是通过与病毒基因的5'NCR竞争结合相同的宿主蛋白多肽而发挥抑制活性的. 研究还发现, 真核细胞中La自身抗原可以明显逆转IRNA的抑制活性, 抗La抗体可以将P52与IRNA或5'NCR探针复合体免疫共沉淀, 从而证实Hela细胞裂解液成份P52与La抗原相同. 从目前的结果可见, IRNA抑制机制为通过与IRES竞争结合宿主蛋白多肽而阻止核糖体与病毒IRES结合, 抑制病毒蛋白翻译, 对真核细胞帽状结构形成依赖性蛋白合成无抑制作用, 这为其在真核细胞中抑制病毒的复制奠定了理论基础.

3.2 IRNA对HCV 蛋白翻译抑制作用

如前所述HCV病毒5'NCR结构与微小RNA病毒5'NCR结构相似, 且已证实HCV蛋白翻译启动机制为IRES介导的内部启动机制. 在HCV蛋白翻译过程中IRES与一些细胞性蛋白多肽, 如La抗原、PTB、P25、P84、P120等相结合而便于核糖体与IRES结合并激发HCV翻译过程. . 由于HCV与PV蛋白翻译中均结合相同的蛋白多肽, 而推测IRNA可能对HCV蛋白翻译具相似的抑制活性. 为了证实这种推断, Das等使用三种表达质粒: 表达HCV IRES与荧光素酶(Lucerase, luc)融合体的pCDHCV-luc、pSV40/ b-gal和表达IRNA的pCDIR. Rib△T7共转染人肝癌细胞系(Huh-7). 结果发现, 同对照组相比, 最低浓度的IRNA可抑制pCDHCV-luc表达物50%的荧光素酶活性, 最高浓度的抑制活性90%, 这提示IRNA能特异性抑制HCV IRES介导的蛋白翻译. 他们进一步构建了含有HCVIRES的双顺反子体外转录载体, 进行体外转录, 结果是1 mgIRNA对由HCV IRES介导的荧光素酶合成的抑制率为20%, 2 μg时抑制率为76%, 而对以帽状结构形成依赖性机制进行的CAT基因蛋白合成抑制性很低, 这证实IRNA对HCV IRES介导蛋白体外翻译同样具抑制性. 研究上发现PV-HCVIRES嵌合体在IRNA表达细胞株中不能复制.

4 存在的问题和展望

IRNA作为一种HCV感染的基因治疗方法还存在许多问题. 例如IRNA进行抗HCV治疗有二种方法: 一种为体外合成IRNA片段, 把这种IRNA作为一种药物来使用, 这就存在IRAN体内稳定性等问题; 另一种方法是将IRNA的重组体导入细胞内进行基因治疗, 这种方法可能有广泛的应用前景, 但同时也存在导入方法等问题. 现阶段需要的是大量有关载体和靶细胞生物学的基础研究, 以及价廉易得的HCV感染动物模型的建立.

丙型肝炎作为一种危害较大的病毒性疾病, 基因治疗能在不同水平影响病毒的复制, 因此是一种很有潜力的治疗方法. IRNA通过阻断病毒蛋白翻译而抑制病毒感染过程, 同时对宿主细胞繁殖代谢物影响, 这为HCV感染基因治疗提供了新思路和新前景, 也许在不久的将来, IRNA治疗能真正成为治疗HCV感染的突破口.

备注

编辑: N/A

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