病毒性肝炎 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-02-15; 11(2): 161-164
在线出版日期: 2003-02-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i2.161
不同载体表达核酶对HBV mRNA细胞内表达的阻断作用
李谨革, 连建奇, 贾战生, 冯志华, 聂青和, 王九平, 黄长形, 白雪帆
李谨革, 连建奇, 贾战生, 冯志华, 聂青和, 王九平, 黄长形, 白雪帆, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心 陕西省西安市 710038
李谨革, 男, 1967-12-04生, 汉族, 内蒙古自治区呼和浩特市人. 医学博士, 讲师.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 39570652.
通讯作者: 李谨革, 710038, 陕西省西安市灞桥区新寺路1号, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心. ban211@fmmu.edu.cn
电话: 029-3374311 传真: 029-3374447
收稿日期: 2002-10-25
修回日期: 2002-11-01
接受日期: 2002-11-20
在线出版日期: 2003-02-15

目的: 探讨多位点自剪切核酶及突变核酶对细胞内HBV mRNA的切割作用.

方法: 构建5个不同的多位点核酶及突变核酶的真核表达载体, 将他们分别与乙型肝炎病毒全基因序列共转染HepG2细胞, 用ELISA, 共聚焦定量及图像分析的方法观察多位点核酶在细胞内对HBV mRNA切割作用.

结果: 构建的真核表达载体在细胞内确可表达出多位点核酶, 核酶及突变核酶在细胞内对HBV基因的表达均有抑制作用, 不同表达载体的抑制率不同, 以tRNA启动子的表达载体抑制效率最高, 达81%, 突变核酶亦有部分反义RNA的抑制效果.

结论: 抗乙型肝炎病毒核酶在细胞内可抑制HBV基因的表达, 不同表达载体其核酶的表达效率不同.

关键词: N/A
引文著录: 李谨革, 连建奇, 贾战生, 冯志华, 聂青和, 王九平, 黄长形, 白雪帆. 不同载体表达核酶对HBV mRNA细胞内表达的阻断作用. 世界华人消化杂志 2003; 11(2): 161-164
Effect of ribozymes on inhibiting expression of HBV mRNA in HepG2 cells
Jin-Ge Li, Jian-Qi Lian, Zhan-Sheng Jia, Zhi-Hua Feng, Qing-He Nie, Jiu-Ping Wang, Chang-Xing Huang, Xue-Fan Bai
Jin-Ge Li, Jian-Qi Lian, Zhan-Sheng Jia, Zhi-Hua Feng, Qing-He Nie, Chang-Xing Huang, Xue-Fan Bai, Jiu-ping Wang, The Center of Diagnosis and Treatment of Infection Diseases of PLA, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'n, Shaanxi, Province, 710038, China
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 39570652.
Correspondence to: Dr. Jin-Ge Li, the Center of Diagnosis and Treatment of Infection Diseases of PLA, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'n, Shaanxi, Province, 710038, China. ban211@fmmu.edu.cn
Received: October 25, 2002
Revised: November 1, 2002
Accepted: November 20, 2002
Published online: February 15, 2003

AIM: To study the activity of ribozymes with multiple cleavage sites and mutated ribozymes on expression of HBV mRNA in HepG2 cells.

METHODS: The triple ribozymes and two cis-ribozymes or two mutated ribozymes were inserted, respectively, into five kinds of eukaryotic plasmids, which were cotransfected into the HepG2 cells with p1.2Ⅱplasmid carring genome of adv-subtype HBV. Cleavage effect of ribozymes on HBeAg and HBcAg were detected by ELISA and laser confocal imaging technique.

RESULTS: The transfected HepG2 cells expressed the expected ribozyme and muta-ribozyme. Intracellular level of HBeAg was surpressed variably with variety of ribozymes. The ribozyme plasmid with tRNA promoter demonstrated the highest inhibitory rate at 81% for suppression HBeAg expression.

CONCLUSION: The ribozymes exert varied inhibitory effect on the expression of HBV in HepG2 cells depending on kinds of eukaryotic expressing plasmids.

Key Words: N/A
0 引言

HBV (hepatitis B virus), 是一种严重危害人类健康的病原体, 能够引起急、慢性乙型肝炎[1-7]. 而且慢性HBV携带者发生肝癌的可能性是正常人的100倍. 目前的研究确信HBV是少数几种致癌病毒之一, HBV的感染、复制等生命活的依赖基因组的转录和表达. 同时HBcAg在细胞内达到一定量后, 可取代细胞染色体中组蛋白, 而使宿主细胞的正常基因表达发生紊乱. 而且HBcAg也免疫因子作用的靶位点[8].

目前常用的药物治疗方法无法阻断细胞中HBV的表达, 起到细胞内的保护作用, 核酶做为一种新效法已显出明显优势[9-32]. 前期的研究中, 我们采用核酶对HBV表达进行阻断, 已取得一定效果, 其抑制率低于66%. 为提高核酶的剪切活性, 我们采用了自剪切载体表达3个位点核酶, 且对照组使用突变核酶, 用不同的载体及启动子表达核酶, 观察核酶对相应蛋白的抑制作用.

1 材料和方法
1.1材料

p1.2Ⅱ(含乙型肝炎病毒基因全序列), 由连建奇博士惠赠, pcDNA3由冯志华博士惠赠. pCI由军事医学科学院王海涛教授惠赠. pBBS212及pCEp由本室保存. HepG2细胞由本校病理教研室惠赠. DMEM, Lipofectamine 2 000购自Gibco公司. ELISA检测试剂盒购自科华公司. 各种抗体购自DAKO公司.

1.2 方法

表达自载切核酶的不同真核表达载体的构建 pcDNA3-Rz123 pcDNA3-mRz12的连接, 将核酶及突变核酶, 用ApaI/Bst XI双酶切, 回收270 bp左右的DNA片段, pcDNA用EcoRⅤ酶切, 回收做为载体. 回收的片段经T4DNA聚合酶补平后, 将二者进行连接, 转化后挑克隆进行鉴定, 鉴定采用XbaI/HindⅢ双酶切或XbaI单酶切(图1). pCI-Rz123 及pCI-mRz123的连接, 将pGEMRz123及pGEM-mRz12用ApaI/BstXI双酶切. 回收补平, pCI用EcoRI及XbaI双酶切后回收补平、连接、转化, 挑取克隆, 用XhoI＋SalI双酶切鉴定大小及用XbaI＋SalI鉴定方向. pBBS212-Rz123及pBBS212-mRz12的连接, 将pBBS212及pcDNA3-Rz123及pcDNA3-mRz12均用Kpn I及Xho I进行双酶切, 回收片段及载体, 双粘端连接, 转化. 挑取克隆, 鉴定用Kpn I及Xho I进行双酶切. pCEp-Rz123 pCEp-mRz12的连接, 将pCEp及pcDNA3-Rz123及pcDNA3-mRz12均用Kpn I及Xho I进行双酶切, 回收片段及载体, 进行双粘端连接、转化, 挑取克隆, 鉴定用Kpn I及Xho I进行双酶切. pDCTRZA-Rz123 与pDCTRZA-mRz12的连接, 将pGEM-Rz123 及pGEMRz-mRz12, 用BstX I单切后切胶回收、补平, 用SacⅠ酶切后回收270 bp及200 bp左右的DNA片段. 将pDCTRZA质粒用BamH I单切后切胶回收、补平, 用Sac Ⅱ酶切酶回收载体DNA, 将载体与片段进行连接、转化. 挑取克隆, 鉴定用Sac Ⅱ、Mlu I进行双酶切(图2). 质粒DNA转染细胞前16-20 h, 用胰酶消化HepG2细胞, 接种于6孔培养板(1×105/孔)37℃, 待细胞生长至50%-70%融合时, 取7.5 mg核酶及突变核酶质粒DNA及7.5 mg p1.2Ⅱ质粒DNA溶于100 mL无血清DMEM中, 混匀; 取Lipofectamine 20 008 mL加无血清DMEM中, 混匀. 缓慢混合, 室温25 min, 加无血清DMEM800 mL至总体积1 mL, 混匀. 用无血清DMEM洗细胞1次, 加入上述转染液于培养板(1 mL/well), 37℃培养16 h, 换完全培养液, 传代, 48 h后更换选择性培养液, 筛选出阳性克隆后, 混合克隆, 次日收集细胞. 细胞用冰浴的PBS缓冲液冲洗3次, 加1 mL含10 mmol/LEDTA的PBS缓冲液消化细胞, 加入1-10 mL PBS悬浮细胞, 计数离心, 去除上清, 悬浮细胞于0.25 mmol/L Tris-HCl (pH7.5) (100 mL/106细胞), 上清即为胞质裂解液, 用于测定HBeAg、ELISA检测按说明书进行. A值在450 nm下读取. 结果均以阳性孔A值/阴性孔A值(P/N)表示, 抑制率按下式计算: 抑制率 = (实验孔P/N值-对照孔P/N值)÷(对照孔P/N值-2.1)×100%免疫荧光及激光共聚焦的检测转染的细胞爬片后固定, 滴加HBcAg抗体IgG, 37℃, 30min, 洗涤5次, 滴加荧光抗体37℃, 30 min, 吹干, 封片, 镜检, 用激光共聚焦显微镜观测, 定量. 免疫细胞化学用SABC法检测(参见说明书), 共转染HepG2细胞染色结果判定, 呈棕色者为阳性, 不着色者为阴性, 依据其着色的深浅, 代表HBcAg表达的量的多少, 不同载体转染各选择5份标本, 40倍镜下随机各选择50个细胞, 测定其胞度的灰度, 计算其均数及标准差, 所有结果均以SPLM软件进行t检测. 细胞的总RNA用异硫氰酸胍法提取, 用32P标记单链DNA的5′末端, 打点杂交方法参见说明书.

图1
图1 四种不同载体的核酶及突变体的构建流程图
图2
图2 pDCTRZA-Rz或mRz构建流程图
2 结果
2.1 构建的不同载体鉴定

pcDNA3-Rz123与pcDNA3-mRz12质粒, 用不同的单酶或双酶酶切鉴定结果与预想结果相同, 说明质粒构建成功(图3). pCI-Rz123 及pCI-mRz12质粒, pBBS212-Rz123及pBBS212-mRz12, pCEp-Rz123及pCEp-mRz12, pDCTRZA-Rz123 及pDCTRZA-mRz12, 用不同的单酶或双酶切鉴定结果与预计结果相吻合, 证明构建质粒成功(图4, 5).

图3
图3 pcDNA3-Rz123酶切鉴定图. A: Xho I/Hind III酶切; B: DL2 000 Marker; C: Xba I 酶切; D: pGEM7Z Hea IIIMarker.
图4
图4 pcDNA3-mRz12(A)、pCI-Rz123(B0)及pCI-mRz129 (C)质粒酶切鉴定图. 1: pGEM7Z Hea III Marker; 2: Xho I/Hind III 酶切; 3、7: pGEM7Z Hea III Marker; 4: Xho I/Sal I酶切; 5: XbaI /Sal I酶切; 6: Xho I/Sal I酶切.
图5
图5 pBBS212-Rz123 pBBS 212-mRz12(A) pCEP-Rz123及pCEP-mRz12(B). pDCTRZA-Rz123及pDCTRZA -mRz12(C)的酶切鉴定图. 1: pBBS212-Rz123; 2: pBBS 212-mRz12; 3, 4: 7Marker; 5: pCEP-mRz12; 6: pCEP-Rz123; 7: pDCTRZA -mRz12; 8: pDCTRZA-Rz123.
2.2 多位点核酶对细胞质中乙型肝炎病毒核心蛋白表达的抑制作用

在将p1.2Ⅱ与多个核酶的不同载体以及突变核酶, 空载体分别转染HepG2细胞, 转染1 wk后胞质中可见到HBeAg的表达. 待筛选出阳性克隆后, 取胞质裂解液进行ELISA测定. 由表中可见, 不同的载体表达核酶, 对HBeAg的表达有不同的抑制率, 以pDCTRZA为最高, 为81%, 其次为pBBS212 76%, 最低为pCEp, 且突变核酶亦有一定的抑制率, 说明其具有部分反义RNA的功能(表1, 图6).

表1 不同载体多位核酶对HBeAg表达的作用(P/N值, 抑制率,).
分组pCDNA3pCIpBBS212pCEPpDCTRZA
核酶组2.6±1.3(0.73)2.9±0.7(0.61)2.5±0.4(0.76)3.1±0.4(0.55)2.6±1.1(0.81)
突变核酶组3.6±1.0(0.18)3.7±0.7(0.21)3.4±0.1(0.26)3.9±1.0(0.21)3.8±1.0(0.39)
空载体组3.9±0.14.2±0.13.9±1.104.4±0.14.9±0.3
图6
图6 核酶在细胞中的表达(RNA打点杂交图). A: 核酶组; B: 突变核酶组. 1: pcDNA; 2: pCI; 3: pBBS212; 4: pCEP; 5: pDCTRZA; 6: 对照组.
2.3 免疫荧光及激光共聚焦的结果

取突变组及核酶组细胞分别进行免疫荧光测定, 荧光强度差异明显. 将其进行共聚焦定量, 以下列公式计算: 抑制率 = 1-核酶组像素密度/突变核酶组像素密度, 经计算, 其最高抑制率可达73.2%.

2.4 免疫组化及图像分析结果

取突变组、空载体组及核酶组两种细胞抗原表达有明显差异(图7). 将此细胞进行图像分析, 亦表明二者有差异.

图7
图7 核酶对细胞内HBV表达的抑制作用. A: 空载体组; B: 核酶表达组.
3 讨论

近年来, 在细胞内应用核酶抑制基因表达已取得了令人瞩目的成果, 尤其抗HIV核酶已在CD4＋淋巴细胞中表达, 并将进行回输人体进行研究. 因此尽管核酶的酶效率较低, 比蛋白质低几个数量级, 但在细胞和活体研究中, 却发现他可以降低靶RNA 90%以上. 可见核酶用于抑制基因表达和基因治疗有着广阔的前景. 乙型肝炎病毒(HBV)的复制必须经过由细胞的RNA多聚酶转录成多拷贝的3.5 kb RNA, 以这一RNA前基因组为模板, 通过逆转录, 自DR1区开始合成负链DNA, 因此前基因组mRNA是关键的一步, 所设计的核酶如能正确切割mRNA, 则可抑制乙型肝炎病毒的复制和表达, 从而起到胞内免疫的作用. 到目前为止, 关于细胞内核酶抗HBV的研究尚不多[32], Beck所用核酶没有在细胞内做到有活性的表达, 而Welch则用串联核酶表达, 做到最高抑制率83%, 南非学者也用荧光蛋白来检测细胞内核酶对HBV的抑制作用, 证实确可抑制HBV的表达.

本室前期的工作亦证实对HBV C区基因的表达有明显的抑制作用. 同时在前期工作的基础上, 我们增加了自剪切序列及核酶的数量, 用自剪切来包装核酶, 避免其两侧的附加序列影响到核酶的切割活性, 使切割核酶与靶RNA作用后更易脱落下来, 进行新一轮的切割. 增加核酶数量则使其能在不同的位点破坏靶RNA, 避免病毒变异造成的单一核酶切割作用的丧失, 也可避免结合蛋白掩盖切割位点. 细胞内核酶的表达, 关键在于启动子的选择, Cotton将核酶基因克隆在蛙蟾tRNA met及密码环中, 提高了核酶的转录水平. Baier利用tRNA启动子可使核酶基因高效表达, 同时tRNA的结构稳定, 可抵抗核酸酶的降解, 因此被认为是细胞内表达核酶的理想启动子. 本研究即将核酶克隆于含有tRNA启动子的真核载体中. 本研究的结果也印证了上述理论, 杂交证实转染细胞中有核酶的mRNA存在, ELISA等方法检测发现核酶及突变核酶对HBV的表达均有抑制作用. pcDNA3, pCI, pBBS212, pCEp, pDCTRZA所达核酶对HBV C基因抑制率为73%, 61%, 76%, 55%, 81%. 最高者为pDCTRZA即tRNA启动子所启动表达的核酶. 这也说明核酶作为一种抗HBV的手段是可行的.

编辑: N/A

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